共轭亚油酸的生物转化和异构体分析

论文摘要

共轭亚油酸（CLA）是一组位置和几何异构体的十八碳共轭二烯酸的统称，在自然界，CLA主要存在于反刍动物的奶、肉及其制品的脂肪中，通常每克脂肪中CLA的含量为2.5-17.7mg，其异构体主要是c9，t11-CLA。体内外实验均表明c9，t11-CLA有抗癌活性。通过化学合成或生物转化法可以大量制备CLA，但化学合成的CLA异构体组成复杂，无法获得单一的CLA异构体，生物转化法在亚油酸异构酶的作用下，可以获得单一的CLA异构体，如c9，t11-CLA、t10，c12-CLA。 本文通过尿素包合法获得纯度较高的亚油酸，采用紫外光谱扫描和HPLC方法筛选到一株高产CLA的乳酸菌，建立了CD-MEKC分析CLA异构体的新方法，通过FTIR、GC-MS、NMR确定了产物的组成，对乳酸菌生物转化CLA的条件进行了优化和放大，并对其亚油酸异构酶进行了初步研究，主要研究结果如下： 1．尿素、溶剂和脂肪酸配比是影响尿素包合法纯化玉米油中亚油酸的主要因素，当混合脂肪酸：尿素：乙醇为1∶3∶6（w.／w.／v.）时，回流15min，包合2h，在室温下，通过一次包合，亚油酸的纯度从44.48％提高到95.68％，得率为72.41％。 2．紫外光谱扫描和HPLC相结合的筛选方法具有快速、准确的优点。通过该方法从33株乳酸菌中筛选到L.acidophilus（CGMCC 1.1854）、L. casei subsp.casei（CGMCC 1.574）、L. plantarum L1和L. helveticus L7共4株乳酸菌能生物转化CLA，它们生物转化得到的CLA均由c9，t11-CLA和t9，t11-CLA两种异构体组成。L. helveticus L7在MRS培养基上生成的c9，t11-CLA的量最高（p＜0.05）。培养基对乳酸菌生物转化CLA有影响，能生物转化CLA的乳酸菌在种上没有规律性。 3．建立了CD-MEKC分析CLA异构体的新方法，最优分析条件是4％（w.／v.）B-CD、54mM SDS、80raM硼酸盐（pH9.0）、8M尿素、4％（v.／v.）乙醇、分离电压30kV、毛细管柱温15℃。CD-MEKC优于目前常用的GC和Ag+-HPLC两种方法，实现了CLA异构体的快速、准确分析。CD-MEKC分析L. helveticus L7生物转化的CLA产物由c9，t11-CLA和t9，t11-CLA组成。 4．通过紫外光谱、傅立叶变换红外光谱、气相色谱-质谱联用分析、1H NMR、重水交换1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、clean-TOCSY和NOESY分析，确证了L. helveticus L7生物转化的两种异构体是c9，t11-CLA和t9，t11-CLA。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 共轭亚油酸的结构和性质
• 2 共轭亚油酸的作用和机制
• 2.1 抗癌作用和机制
• 2.2 减肥作用和机制
• 3 共轭亚油酸的生产方法
• 3.1 LA的制备
• 3.2 CLA的化学合成法
• 3.3 CLA的生物转化法
• 4 CLA异构体的分析方法
• 4.1 气相色谱
• 4.2 银离子高效液相色谱
• 4.3 气质联用
• 4.4 毛细管电泳
• 5 亚油酸异构酶的纯化及性质
• 6 小结
• 第二章 亚油酸的制备
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 原料的选择和玉米油中混合脂肪酸的组成
• 3.2 亚油酸制备条件的优化
• 4 小结
• 第三章 产共轭亚油酸乳酸菌的筛选
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 紫外光谱扫描分析CLA
• 3.2 HPLC分析CLA
• 3.3 CLA回收率试验
• 3.4 生物转化CLA乳酸菌的筛选
• 4 小结
• 第四章 胶束电动色谱分析CLA异构体方法的研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 CD-MEKC分离CLA异构体的条件优化
• 3.2 CD-MEKC分析CLA异构体方法的确认
• 3.3 样品的分析
• 4 小结
• 第五章 L. helveticus L7生物转化的CLA结构分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与分析
• 3.1 L. helveticus L7生物转化的CLA异构体单体制备
• 3.2 紫外光谱
• 3.3 傅立叶变换红外光谱
• 3.4 气相色谱-质谱联用分析
• 3.5 核磁共振谱
• 4 小结
• 第六章 L. helveticus L7生物转化条件的优化和放大试验
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 分批发酵单因素条件优化
• 3.2 分批发酵的正交试验
• 3.3 菌体直接生物转化的单因素条件优化
• 3.4 菌体直接生物转化时的正交试验
• 3.5 分批发酵和菌体直接生物转化两种方法的比较
• 3.6 5L发酵罐分批发酵动力学
• 4 小结
• 第七章 L. helveticus L7亚油酸异构酶的初步研究
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 亚油酸异构酶的分离纯化
• 3.2 亚油酸异构酶的性质
• 4 小结
• 第八章 主要研究结果和建议
• 1.主要研究结果
• 2.建议
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文和申请的专利
• 个人简历
• 致谢
• 附录1：CLA1的红外谱图
• 附录2：CLA2的红外谱图
• 附录3：CLA1甲酯的MTAD加合物的总离子流色谱图
• 附录4：CLA1甲酯的选择离子质荷比（m／z 294）色谱图和质谱图
• 附录5：CLA1甲酯的MTAD加合物的选择离子质荷比（m／z 250）色谱图和质谱图
• 附录6：CLA2甲酯的MTAD加合物的总离子流色谱图
• 附录7：CLA2甲酯的选择离子质荷比（m／z 294）色谱图和质谱图
• 附录8：CLA2甲酯的MTAD加合物的选择离子质荷比（m／z 250）色谱图和质谱图
• 1H NMR'>附录9：CLA2的¹H NMR
• 1H NMR'>附录10：CLA2的重水交换¹H NMR
• 13C NMR'>附录11：CLA2的¹³C NMR
• 1H-¹H COSY谱图'>附录12：CLA2的¹H-¹H COSY谱图
• 附录13：CLA2的clean-TOCSY谱图
• 附录14：CLA2的NOESY谱图