用酵母双杂交技术筛选HCV核心蛋白与人胰腺cDNA文库结合蛋白基因

论文摘要

[目的]:用酵母双杂交共转染和配合技术筛选经纯化鉴定的已知人胰腺cDNA文库与丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）核心蛋白（core）相互作用的蛋白的编码基因,为研究HCVcore蛋白基因在HCV感染所致MS中的作用提供了实验依据。[方法]:常规扩增人类胰腺cDNA文库并纯化、鉴定。通过多聚酶链反应（PCR）法扩增HCVcore基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒“pGBKT7—core”。首先应用共转染技术,把诱饵质粒与文库质粒共同转染酵母细胞AH109,在四缺培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行双重阳性菌落筛选,提取蓝色酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,进行生物信息学分析。然后本研究又应用了配合技术,将文库质粒转染酵母细胞Y187,在亮氨酸缺陷型培养基（SD/-Leu）上筛选阳性菌落。pGBKT7-core转染酵母细胞AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp）上筛选阳性菌落。将两种酵母细胞进行配合,同样也要在四缺培养基和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选,提取阳性酵母菌落质粒,电转化大肠埃希菌DH5α后再提取质粒测序,测序结果进行生物信息学分析。[结果]:得到预转化的人胰腺cDNA文库,其滴度为4×107,纯化后的文库质粒浓度约为0.34mg/ml。用EcoRⅠ,X hoⅠ双酶切鉴定cDNA文库的多样性,结果显示插入片断大小不一。用共转染技术,筛选出6种与HCVcore蛋白结合蛋白基因,包括人类胰蛋白酶1,人类羧肽酶A1,人类胰凝乳蛋白C,人类富含赖氨酸卷曲螺旋1,人类锌指基质蛋白1,人类未知特征的骨髓蛋白BM044。用配合技术,筛选出11种与HCVcore蛋白相结合蛋白基因,包括人类辅脂肪酶、人类驱动蛋白家族3B、人类羧肽酶B1、人类线粒体蛋白基因、人类胰蛋白酶1、人类胰蛋白酶2等。[结论]:本研究用酵母双杂交共转染和配合技术筛选人胰腺cDNA文库,分别获得6种和11种与HCVcore蛋白相结合蛋白基因。该结果为进一步探讨HCV感染导致MS提供了新思路,而且还证实了配合技术优于共转染技术,说明了酵母双杂交系统的进步和发展。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 引言
• 第一章 综述
• 1.1 HCV和MS关系的研究
• 1.2 酵母双杂交技术的研究进展
• 第二章 人胰腺cDNA文库的扩增、纯化与鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法和试剂配方
• 2.1.2.1 胰腺文库的扩增
• 2.1.2.2 文库质粒的纯化
• 2.1.2.3 文库质粒的鉴定
• 2.2 结果
• 2.2.1 胰腺文库的滴定
• 2.2.2 胰腺文库的扩增
• 2.2.3 文库质粒的提取
• 2.2.4 文库多样性的鉴定
• 2.3 讨论
• 第三章 酵母双杂交技共转染系统筛选HCV core蛋白与人胰腺cDNA文库相结合蛋白基因
• 3.1 材料和方法试剂
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法及试剂配方
• 3.2 结果
• 3.2.1 共转效率的计算
• 3.2.2 部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果
• 3.2.3 cDNA测序与同源性分析初步结果
• 3.3 讨论
• 第四章 酵母双杂交配合系统筛选HCVcore蛋白与人胰腺cDNA文库相结合蛋白基因
• 4.1 材料和方法试剂
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 所用方法及试剂配方
• 4.2 结果
• 4.2.1 pGBKT7-core重组质粒转化AH109酵母细胞的菌落PCR
• 4.2.2 诱饵培养物与文库培养物的相互配合
• 4.2.3 阳性克隆的筛选
• 4.2.4 部分筛选克隆GglⅡ酶切鉴定结果
• 4.2.5 测序与同源性分析结果
• 4.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及读研期间主要研究成果