多烯大环抗真菌剂纳他霉素的研究

论文题目: 多烯大环抗真菌剂纳他霉素的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 李东

导师: 杜连祥

关键词: 纳他霉素,生物防腐,诱变育种,发酵工艺,代谢调控

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 根据微生物发酵工程理论,本文对天然生物食品防腐剂纳他霉素（Natamycin）的发酵生产工艺进行了深入的研究,包括产生菌选育方法、菌种生理生化特性、菌种发酵特性和摇瓶发酵条件、菌种诱变育种、实验室调控发酵条件及30M3规模生产试验、产物分析检测和鉴定、纳他霉素抑菌谱及其应用、纳他霉素安全性等研究。经过以上努力,该课题已于2003年实现工业化大规模生产,填补了国内生产空白。该课题的主要研究内容和结果如下: （1）根据国际上已报道的纳他霉素产生模式菌背景,结合放线菌目（Actinomycetales）链霉菌科（Streptomycetacese）链霉菌属（Streptomyces）的菌种特性,对纳他霉素产生菌的生理生化特性进行了比较研究,获得纳他霉素产生菌种的基础背景信息;建立了比较完善的产纳他霉素链霉菌的筛选方法,得到一株产生纳他霉素0.825g/L的菌株S3; （2）研究了所获菌株S3的摇瓶发酵条件,应用正交设计试验法优化种子培养基和培养条件。在该条件下,纳他霉素产量提高到2.41g/L。（3）以Natamycin产生菌S3为出发菌株,利用紫外线和硫酸二乙酯（DES）进行诱变,采用链霉素抗性筛选法,结合摇瓶复筛,获得一株纳他霉素产量达到2.97g/L的突变株SG-56。（4）通过实验室5L发酵罐的调控发酵条件研究和30M3大型发酵罐生产试验,证明了分批补料发酵工艺的实用性,纳他霉素发酵产量平均达到4.8g/L发酵液,最大到5.4g/L,产物提取率大于60%。（5）对纳他霉素生产样品进行了红外图谱、紫外光谱、1H、13C核磁共振、质谱、X-射线衍射图谱等的检测鉴定,达到国际标准。（6）对所获得的产物纳他霉素的抑菌谱进行了研究,对纳他霉素在饲料中的应用进行了探讨。最后探讨了纳他霉素的安全性,研究了所获产品纳他霉素原料口服给药的急性毒性。本论文在纳他霉素发酵研究领域的创新之处在于: （1）本论文首先在国内建立了纳他霉素产生菌的选育和鉴定方法获得五株产生纳他霉素的链霉菌,建立了检测发酵液中纳他霉素含量的HPLC法,将管碟扩散法应用于纳他霉素的生物活性检测; （2）在国内首次将链霉素抗性筛选法结合传统诱变应用于多烯大环内酯类抗菌素产生菌的选育中,筛选出链霉素抗性基因突变株,通过摇瓶发酵复筛获得纳他霉素高产菌株,产量达到2.97g/L; （3）开创性的对纳他霉素生物合成代谢调控发酵途径进行了探讨,确定了一套完整的发酵调控工艺条件,利用该工艺条件完成了中试生产和扩大生产实验,30吨规模化生产试验获得成功,发酵产率达到4.8g/L,最大到5.4g/L,提取回收率大于60%,达到并超过最初设定的研究目标,达到国际同类研究的

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.1 纳他霉素概述

1.1.1 纳他霉素的发现和命名

1.1.2 纳他霉素的物理和化学性质

1.1.3 纳他霉素的活性和稳定性

1.1.4 纳他霉素的结构性质

1.2 纳他霉素的应用

1.2.1 纳他霉素的抗微生物性质和安全性

1.2.2 纳他霉素在食品、医疗和兽药中的应用

1.2.2.1 纳他霉素在食品中的应用

1.2.2.2 纳他霉素在医疗中的应用

1.2.2.3 纳他霉素在兽药中的应用

1.3 纳他霉素生产菌与生物合成途径

1.3.1 纳他霉素产生菌菌株特征

1.3.2 多烯大环内酯抗生素的生物合成途径

1.3.3 纳他霉素的生物合成调控发酵

1.4 纳他霉素国内外的研究水平和生产状况

1.4.1 纳他霉素国内的研究情况

1.4.2 国外发酵法生产纳他霉素的概况

1.4.3 纳他霉素产生菌的基因工程研究进展

1.4.4 纳他霉素分离提取的研究概况

1.5 纳他霉素的分析检测研究

1.5.1 纳他霉素的生物检测方法

1.5.2 高效液相色谱(HPLC)法

1.5.3 纳他霉素的鉴定方法

1.6 本论文的立项背景及内容

第二章纳他霉素菌种筛选和鉴定研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 实验土壤样品及纳他霉素产生菌

2.2.2 药品和试剂

2.4.3 仪器和设备

2.4.4 培养基

2.3 实验方法

2.3.1 含菌土样的采集和保藏

2.3.2 传统的筛选方法

2.3.3 改进的筛选方法

2.3.4 鉴别实验方法

2.3.5 紫外扫描检测方法

2.4 实验结果与讨论

2.4.1 筛选的实验方法

2.4.2 鉴别实验结果

2.4.3 液体发酵产物紫外扫描光谱

2.5 本章小结

第三章纳他霉素菌种发酵工艺的初步研究

3.1 前言

3.2 实验材料和方法

3.2.1 实验材料

3.2.1.1 菌种

3.2.1.2 主要药品

3.2.1.3 主要仪器

3.2.1.4 相关溶液

3.2.1.5 培养基

3.2.2 实验方法

3.2.2.1 菌种培养方法

3.2.2.2 琼脂块法分离纯化菌种

3.2.2.3 纳他霉素生物检测—管碟扩散法

3.2.2.4 摇瓶发酵方法

3.2.2.5 生产菌生物量的测定——菌体干重法

3.2.2.6 发酵液残糖的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 管碟扩散法测定纳他霉素效价方法的确定

3.3.2 琼脂块法初筛

3.3.3 种子质量对发酵的影响

3.3.4 菌种培养条件的优化

3.4 本章小结

第四章纳他霉素菌种诱变育种的研究

4.1 前言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.2.2.1 生物检测法对纳他霉素产量的测定

4.2.2.2 高效液相色谱法检测纳他霉素的产量

4.2.3 诱变育种

4.2.3.1 琼脂块法分离纯化菌种

4.2.3.2 孢子悬浮液的制备与孢子计数

4.2.3.3 孢子的链霉素最小抑制浓度(MIC)测定

4.2.3.4 硫酸二乙酯(DES)诱变方法的确定

4.2.3.5 紫外线诱变方法的确定

4.2.3.6 链霉素抗性突变株的筛选

4.2.4 菌种性能的研究方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 高效液相色谱法检测纳他霉素的产量

4.3.2 出发菌株的选择与纯化

4.3.3 DES诱变及链霉素抗性菌株的筛选

4.3.4 紫外线诱变选育纳他霉素生产菌株

4.3.5 菌株SG-56发酵过程曲线

4.4 本章小结

第五章纳他霉素发酵工艺条件优化和生产试验

5.1 前言

5.2 实验材料和方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验方法

5.3 实验结果与讨论

5.3.1 纳他霉素发酵特性的研究

5.3.2 培养基成分的优化

5.3.3 摇瓶发酵培养基组成的优化实验

5.3.4 前体物对纳他霉素产量的影响

5.3.5 磷酸镁对纳他霉素发酵的影响

5.3.6 优化条件下的5L自动罐分批发酵试验

5.3.7 发酵生长生产耦合性研究

5.3.8 补糖浓度的选择

5.3.9 控制pH下的5L自动发酵罐间歇补料分批发酵

5.3.10 纳他霉素生产试验

5.4 本章小结

第六章纳他霉素生产样品的分析鉴定

6.1 前言

6.2 实验方法与仪器

6.3 实验结果与讨论

6.3.1 纳他霉素红外光谱分析

6.3.2 纳他霉素紫外光谱分析

6.3.3 纳他霉素~1H核磁共振图谱和~(13)C核磁共振图谱分析

6.3.4 纳他霉素的EI质谱分析

6.3.5 纳他霉素的X-衍射谱图分析

第七章纳他霉素抑菌谱的测定及应用研究

7.1 纳他霉素抑菌谱的测定

7.1.1 前言

7.1.2 实验材料

7.1.3 实验方法

7.1.4 实验结果

7.2 纳他霉素在饲料中的应用研究

7.2.1 实验材料

7.2.2 实验方法

7.2.3 实验结果

7.2.4 结果讨论

7.3 本章小结

第八章纳他霉素的安全性探讨

8.1 前言

8.1.1 纳他霉素的口服安全性

8.1.2 纳他霉素的急性毒性研究情况

8.1.3 纳他霉素致突变、致畸、长期毒性等的研究

8.1.4 国外资料结果小结

8.2 纳他霉素原料的急性毒性实验研究

8.2.1 原料药口服给药的急性毒性试验试验目的

8.2.2 原料药口服给药的急性毒性试验试验材料

8.2.3 原料药口服给药的急性毒性试验实验方法

8.2.4 原料药口服给药的急性毒性试验试验结果

8.2.5 原料药口服给药的急性毒性试验结论

8.3 纳他霉素的卫生标准分析结果

8.4 本章小结

第九章全文结论与展望

9.1 结论

9.2 创新点

9.3 展望

附录1：攻读博士学位期间承担的科研课题及学习进修情况

附录2：攻读博士学位期间出版的著作及发表的论文

致谢

发布时间: 2007-01-10

参考文献

[1].纳他霉素高产菌株选育、发酵条件优化、发酵动力学及溶解度的研究[D]. 骆健美.浙江大学2005
[2].纳他霉素高产菌株空间育种、工艺优化及工业放大研究[D]. 梁景乐.浙江大学2007
[3].恰塔努加链霉菌纳他霉素高效生物合成的分子机制[D]. 刘水平.浙江大学2015

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