小梅山猪MSTN三种重组蛋白的制备及其免疫对小鼠生长的影响

论文摘要

1研究背景与目的肌肉生成抑制素基因（myostatin,MSTN）,又称生长分化因子-8（GDF-8）,是转化生长因子β（TGF-β）超家族成员之一,是近几年发现的骨骼肌生长负调控因子,其活性的丧失,可引起动物肌肉的过度发育,肌纤维直径变大或肌纤维数增加,表现为动物的“双肌”性状。MSTN相关研究的突破将对于提高猪、鸡、牛等肉用畜禽的生产性能以及临床治疗肌肉消耗和衰竭等症具有特别重要的意义。本研究采用原核表达方法制备了基于猪MSTN活性区的三种融合蛋白,用于免疫小鼠,制备其抗血清,比较分析三种候选蛋白免疫小鼠对生长的影响,旨在寻找促进机体肌肉生长的蛋白疫苗,探讨运用主动免疫方法改善畜禽肌肉质量的可行性。2方法与结果应用PCR方法扩增小梅山猪MSTN编码成熟区蛋白基因,借助Linker将通用T细胞表位TT、PADRE连接到MSTN成熟区N末端,构建编码MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN的克隆和表达载体,并在BL21工程菌实现三种候选蛋白的表达、提取与鉴定;利用提取的MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN蛋白分别免疫小鼠,ELISA法检测免疫后各组血清中抗MSTN抗体滴度,比较各组小鼠体重、料肉比、胴体、胸大肌、股四头肌、股二头肌、腓肠肌和腹腔游离脂肪等变化情况。最终结果显示:本研究正确的构建了MSTN、TT-MSTN、PD-MSTN表达载体,完成了融合蛋白的表达及鉴定,实现了三种候选蛋白的大量制备;三种候选蛋白免疫小鼠后均可诱导出MSTN特异性中和抗体,其中TT-MSTN、PD-MSTN效果较好（滴度＞5×103）;三种候选蛋白疫苗对小鼠肌肉组织各部分生长均有一定积极影响,并且TT-MSTN效果优于其他候选蛋白疫苗;与MSTN、PD-MSTN相比,TT-MSTN候选疫苗在促进小鼠生长和降低料肉比等方面有一定改善作用,但效果不显著。3结论成功构建了MSTN三种重组蛋白疫苗,系统地比较了三种疫苗间的免疫效果,确证Th细胞辅助表位TT830-844和PDARE在增强MSTN自体疫苗的免疫原性方面有一定的作用,同时TT-MSTN蛋白作为未来候选疫苗在促进机体肌肉生长和提高机体生长性能方面有一定表较优势。这些研究为进一步研究肌肉生长发育机制、开发促生长的生物新技术奠定理论依据并提供了技术支撑。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 1 生成抑制素研究概述
• 1.1 生成抑制素基因的发现
• 1.2 肌生成抑制素基因的结构与染色体定位
• 1.3 肌生成抑制素基因与蛋白同源性分析
• 1.4 肌生成抑制素基因的时空表达
• 1.5 肌生成抑制素的组织分布
• 1.6 肌生成抑制素的生物学功能
• 1.6.1 肌生成抑制素对肌肉组织发育与再生的调控
• 1.6.2 肌生成抑制素对脂肪沉积的影响
• 1.7 肌生成抑制素的作用机制
• 1.7.1 肌生成抑制素基因通过基因突变形成双肌性状及其导致肌肉充分发育的原因
• 1.7.2 肌生成抑制素生物活性形成过程
• 1.7.3 肌生成抑制素对成肌细胞的调控
• 1.7.4 肌生成抑制素的信号传导途径
• 1.8 肌生成抑制素应用前景与发展趋势
• 1.8.1 肌生成抑制素在畜牧业中的应用前景与发展趋势
• 1.8.2 生成抑制素在医疗领域中的应用前景与发展趋势
• 2 免疫技术在动物生产上的应用
• 2.1 动免疫技术在动物生产中的应用
• 2.2 被动免疫技术在动物生产中的应用
• 3 关于通用T细胞辅助表位
• 4 外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展
• 4.1 启动子的选择
• 4.2 表达载体的类型
• 4.2.1 非融合表达载体
• 4.2.2 融合表达载体
• 4.2.3 分泌表达载体
• 4.2.4 表面呈现表达载体
• 4.3 二硫键的影响
• 5 小梅山猪研究概况
• 试验研究
• 目的与意义
• 试验Ⅰ.MSTN基因克隆、表达及规模纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要设备
• 1.3 实验试剂及其配制
• 1.3.1 培养基
• 1.3.2 质粒提取与克隆所用试剂
• 1.3.3 蛋白质电泳所用溶液的配制
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 重组MSTN、PADRE-MSTN、TT-MSTN蛋白疫苗的设计
• 1.4.2 表达载体pET-MSTN、pET-PADRE-MSTN、pET-TT-MSTN的构建
• 1.4.3 基因组DNA提取
• 1.4.4 引物设计与合成
• 1.4.5 重组克隆载体的构建、筛选及鉴定
• 1.4.6 重组表达载体的构建、筛选及鉴定
• 1.4.7 MSTN、TT-MSTN、PADRE-MSTN重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增
• 2.2 阳性克隆载体pMD 18-T-MSTN的筛选及鉴定
• 2.3 阳性表达载体pET-MSTN、pET-TT-MSTN、pET-PD-MSTN的鉴定
• 2.4 核苷酸序列测序及序列相似性比较
• 2.5 融合蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.6 融合蛋白的Westernblot鉴定
• 3 讨论
• 4 结论
• 试验Ⅱ.用三种MSTN融合蛋白分别免疫小鼠对生长的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要设备
• 1.3 实验试剂及其配制
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 动物免疫
• 1.4.2 血清抗体滴度的ELISA检测
• 1.4.3 小鼠骨骼肌形态分析
• 1.4.4 据统计学处理
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠免疫血清ELISA抗体滴度测定
• 2.2 三种候选蛋白疫苗免疫对小鼠生长的影响
• 2.2.1 免疫对小鼠各个时期增重的影响
• 2.2.2 疫对小鼠生长效率的影响
• 2.2.3 免疫对小鼠肌肉组织和脂肪组织生长的影响
• 2.2.4 疫小鼠肌肉组织形态变化
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录