谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的分子进化及其酶学性质的研究

论文摘要

海藻糖合成酶是酶法生产海藻糖的关键酶,通过分子内转糖基作用,将α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖转化为α,α-1,1糖苷键连接的海藻糖,由于海藻糖对生物大分子的非特异性保护作用,使其备受关注,为了降低生产成本,各国科学家纷纷对其生产和应用技术进行了大量的研究。现有的海藻糖合成酶存在一些缺点:如转化效率不够高、热稳定性较差、反应时间较长等。因此,有必要对已有的海藻糖合成酶进行改造,使其工业性能有所改善。本论文采用半理性设计方法,以海藻酮糖合成酶（trehalulose synthaseMutB from Pseudomonas mesoacidophila MX-45）晶体结构为模板,在网站SWISS-MODEL上对来自谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）海藻糖合成酶进行同源建模,并对其初始结构作了能量优化,结合分析不同来源的海藻糖合成酶基因的保守序列,选择了保守区的位点F244、D247、R245、E289进行定点（饱和）突变,并在保守区外的A288进行定点突变,结果表明:R245、E289分别饱和突变为其它的19个氨基酸后,共获得了38个突变子,但均无酶活;对D247定点突变成结构相似的氨基酸即Glu和Asn后也丧失酶活;突变体F244C、F244L、F244W、F244Y和A288G的比活力均大大降低,分别降低为野生型（WT）的38%、24%、62%、64%和35%,而A288变成T288后没有酶活。与野生型（WT）相比,突变酶F244C、F244W、A288G的Km值基本不变,突变酶F244L、F244Y对底物麦芽糖的亲和力降低了;突变酶F244Y的最适温度和野生型一样,均为27℃,而F244C、F244L、F244W和A288G比野生型提高了5℃;各突变体的最适pH均有所下降,其中F244C、F244Y和A288G最适反应pH为7.5,比野生型的8.0均下降了约0.5个单位,而F244L和F244W均为6.5,均下降了近1.5个单位;突变酶的热稳定性均有不同程度的提高,其中F244Y、F244W和A288G的Tm值比野生型的提高约1℃;F244L提高约2℃,而F244C热稳定性提高了近4℃。通过分析和比较这些突变酶的性质变化,可为今后研究海藻糖合成酶的结构和功能的关系提供有用的数据和信息,为进一步对海藻糖合成酶的分子改造提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 海藻糖的结构和自然界分布
• 1.2 海藻糖的生物功能
• 1.3 海藻糖的应用前景
• 1.4 海藻糖的制备方法和研究进展
• 1.5 酶分子改造的理论基础及研究进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.2 质粒DNA的大量制备
• 2.2.3 质粒DNA的小量制备
• 2.2.4 重组质粒pSE380-tres-gluhis的构建
• 2.2.5 重组菌株的诱导表达
• 2.2.6 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.7 海藻糖合成酶的纯化
• 2.2.8 海藻糖合成酶的活力测定
• 2.2.9 蛋白质浓度测定
• 2.2.10 同源建模
• 2.2.11 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶突变库的构建
• 2.2.12 野生型和突变酶的表达、纯化和酶学性质比较
• 第三章 结果与分析
• 3.1 带有6His标记的谷氨酸海藻糖合成酶基因（pSE380-tres-gluhis）的克隆、表达和纯化
• 3.1.1 tres-gluhis基因的克隆
• 3.1.2 PCR产物与载体的酶切与连接
• 3.1.3 野生型酶的表达、纯化及SDS-PAGE分析
• 3.2 谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶的同源建模
• 3.3 ProSa2003软件对突变位点的能量分析
• 3.4 突变型海藻糖合成酶基因表达质粒的构建
• 3.5 突变型海藻糖合成酶基因的序列分析
• 3.6 突变型和野生型海藻糖合成酶的纯化和SDS-PAGE分析
• 3.7 野生型和突变酶酶学性质分析比较
• 3.7.1 野生酶和突变酶的酶活及比活力的测定
• 3.7.2 最适温度的测定
• 3.7.3 最适pH的测定
• 3.7.4 热稳定性的测定
• 3.7.5 Km值的测定
• 第四章 讨论
• 4.1 海藻糖合成酶突变位点的选择
• 4.2 海藻糖合成酶最适温度的改变对海藻糖生产的应用价值
• 4.3 突变对海藻糖合成酶酶学性质的影响
• 4.4 ProSa2003软件对突变位点的稳定性分析
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文