论文摘要
水稻是世界上重要的粮食作物,悬浮细胞对于水稻分子生物学研究是一个非常有用的工具。磷脂酶D基因在植物生长发育过程中起重要的调节作用。目前,国内还没有粳稻日本晴细胞悬浮系以及对磷脂酶D基因功能研究的相关报道。本文以粳稻日本晴为材料,研究其细胞悬浮系的制备与超低温保存方法,并对OsPLD基因进行克隆、器官特异性表达分析以及在酵母中进行基因功能鉴定,结果如下: （1）以日本晴水稻的成熟胚为外植体,在pH 值为5.8 的NB +2mg/L 2,4-D+3%Suc+7%Agar 培养基上诱导愈伤组织,25℃、黑暗条件下培养2 个月后,可以得到大量胚性愈伤组织。选择淡黄色、质地疏松的胚性愈伤组织为悬浮培养的细胞来源,并在pH 值为5.3的液体培养基中,26℃、黑暗条件、110～130rpm/min进行悬浮培养,再过3 个月,即可得到理想的细胞悬浮系。该悬浮细胞可以使用一步法进行保存,即经过含有0.26μg/L 的ABA 预培养溶液中培养5d,再用化学冷冻防护剂DMSO（10%）+PEG（10%）+Suc（10%）处理,-30℃下脱水2h 后投入液氮中长期保存。日本晴水稻悬浮细胞系的建立为外源基因的转化提供了理想的受体材料,同时也为在细胞水平上研究水稻生理生化指标提供均一的材料。（2）水稻磷脂酶D（OsPLD）基因是一个家族基因,至少包含16 个成员,在植物的生长过程中起重要作用。以水稻整株幼苗为材料,采用RT-PCR 方法克隆了磷脂酶D家族基因中OsPLD V1、α1、λ、P1 4 个基因,全长分别为2550bp、2439 bp、2451 bp、3606 bp;分别在水稻的根、茎、叶、花和由成熟胚诱导愈伤组织建立的悬浮细胞中,使用半定量PCR 的方法对这4个基因进行了器官特异性表达分析,结果发现只有OsPLDV1只在花中特异性表达,另外3 个基因在各器官中均表达;在酵母突变体中进行基因功能鉴定,结果发现这4 个基因都不表达,这表明酵母与水稻的PLD基因存在较大差异。这可以为该家族其它基因的克隆和功能鉴定提供一定的理论基础。