成年猪与仔猪肝脏γ猪肝羧酸酯酶表达差异研究

论文摘要

肝脏是动物（或人）机体清除药物的主要器官,它可表达多种药物代谢酶（Drug-metabolizing enzyme, DMEs）,γ猪肝羧酸酯酶（γpig liver carboxlesterase,γ-PLE, EC 3.1.1.1）是肝脏最重要最常见的药物代谢酶之一,属于Ⅰ相药物代谢酶。具有促使各种包含酯类、胺类和硫酯药物生物转化的功能,以及激活前药物和代谢的作用。除此以外,还参与多种环境毒物、致癌物质的解毒和代谢；参与脂质运输和代谢以及参与信号跨膜转导及保持生物膜的完整性。药物在临床上的联合应用是目前最为常见的用药方式,而不论两种或多种药物同时或连续应用,药物治疗效果变化的可能性是存在的；临床用药时,药物在不同日龄、不同品种猪之间的使用剂量不同；而这些作用的产生大多数是由药物代谢酶介导的。因此,对于γ-PLE表达谱的研究将为这些临床用药中存在的问题提供理论依据。本研究运用Western blot、Real-time PCR技术,对γ-PLE在不同日龄猪肝脏中的表达,进行了γ-PLE表达谱的研究,取得如下研究结果：1.1,猪肝羧酸酯酶基因的克隆及重组表达质粒的构建提取猪肝脏总RNA, RT-PCR获全长cDNA, PCR扩增获得γ-PLE基因片段,大小为1686 bp,酶切回收后连接到pET-32a（+）载体,对重组质粒进行PCR鉴定、酶切分析及测序分析,与GenBank序列号为X63323的γ-PLE基因片段序列进行BLAST比对,同源性达99%,成功构建pET32a-yPLE重组表达质粒。2.γ猪肝羧酸酯酶的原核表达及表达蛋白的纯化和活性检测携带γ-PLE基因的pET32a-yPLE表达质粒在E. coli BL21 （DE3）中进行表达,并对表达条件进行优化,结果显示pET32a-yPLE在37℃条件下诱导5h后表达量最佳,表达物分子量约为75 KDa。Western blot证实重组蛋白具有较好的免疫反应活性。经包涵体复性纯化,获得了高纯度的表达蛋白,浓度为2.01mg/mL,为制备兔抗γ-PLE多抗奠定了基础；表达产物可进行酶活性染色,说明复性后的表达产物具有酶活性。3.兔抗γ-PLE多抗的制备与纯化用纯化的表达蛋白pET32a-yPLE免疫健康家兔,经多次免疫,制备了兔抗PET32a-yPLE的高免血清。将所得高免血清采用饱和硫酸铵粗提和G-200过柱纯化,最后得到了纯化的兔抗pET32a-yPLE多克隆抗体。Western blot证实此多抗具有较好的免疫反应活性,为γ-PLE的表达谱的研究奠定了基础。4.γ-PLE表达谱的研究提取仔猪、成年猪肝脏蛋白,以β-actin蛋白为内参蛋白,利用制备的多抗做Western blot,实验结果表明γ-PLE在成年猪表达量较高；提取仔猪和成年猪肝脏总RNA,反转录cDNA,以GAPDH基因为内参基因,利用荧光定量PCR技术,实验结果表明γ-PLE在成年猪表达量是仔猪的31倍,差异极显著。分别从蛋白水平和mRNA水平进行了γ-PLE表达谱的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 药物代谢酶与药物代谢
• 1.2 羧酸酯酶
• 1.2.1 概述
• 1.2.2 羧酸酯酶的分布
• 1.2.3 羧酸酯酶的一级结构
• 1.2.4 羧酸酯酶的功能
• 1.2.5 羧酸酯酶的多态性及表达谱
• 1.2.6 羧酸酯酶的表达调控分子机制
• 1.3 猪肝羧酸酯酶PLE
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 猪肝羧酸酯酶PLE同工酶
• 1.3.3 PLE同工酶结构
• 1.3.4 PLE基因表达
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 γ猪肝羧酸酯酶γ-PLE的克隆
• 3.2.2 γ猪肝羧酸酯酶原核表达质粒的构建
• 3.2.3 γ猪肝羧酸酯酶蛋白的表达与纯化
• 3.2.4 抗γ-PLE多克隆抗体的制备及纯化
• 3.2.5 Western blot检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 3.2.6 Real-Time PCR检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 4 实验结果
• 4.1 PCR扩增结果
• 4.2 表达载体的构建及鉴定
• 4.3 诱导表达与纯化后分析
• 4.3.1 诱导表达条件的摸索
• 4.3.2 表达蛋白可溶性检测
• 4.3.3 重组蛋白的纯化
• 4.3.4 重组蛋白的免疫性检测
• 4.3.5 重组蛋白的酶活性染色
• 4.4 兔抗pET32a-γPLE多抗的鉴定
• 4.4.1 间接ELISA测定抗体效价
• 4.4.2 γ-PLE多抗IgG的纯化
• 4.4.3 多抗的Western blot免疫反应性检测
• 4.5 Western blot检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 4.6 Real-Time PCR检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 4.6.1 Real-Time PCR扩增
• 4.6.2 Real-Time PCR扩增曲线
• 4.6.3 Real-Time PCR数据分析
• 5 讨论
• 5.1 γ-PLE基因的PCR引物设计
• 5.2 原核表达载体的选择
• 5.3 菌种的选择
• 5.4 γ-PLE蛋白的酶活性染色
• 5.5 Western blot法检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 5.6 Real-Time PCR法检测成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 5.7 成年猪、仔猪γ-PLE的表达差异
• 5.8 本研究不足之处
• 6 结论
• 参考文献
• 附录1:γ-猪肝羧酸酯酶基因片段序列（GenBank登录号:X63323）
• 附录2:γ-猪肝羧酸酯酶基因片段序列比对结果
• 致谢