脱-γ-羧基凝血酶原促进肝癌增殖与转移机制研究

论文摘要

研究背景凝血酶原是在肝脏中合成的血清凝血因子,也是凝血酶的前体物。在凝血酶原前体的谷氨酸区有十个谷氨酸残基,当有足够的维生素K存在时,这些谷氨酸残基将全部转化成γ-羧基谷氨酸而成为正常凝血酶原。当维生素K不足或存在维生素K拮抗剂时,这些谷氨酸未被全部羧化而称为脱-Y-羧基凝血酶原（DCP）。由于γ-羧基谷氨酸中的羧基是与钙结合的一个功能区,它的缺乏失去了与钙结合的基础,故DCP无凝血酶原的功能。DCP作为肝癌标志物已用于临床诊断中。研究DCP的结构可以发现,其中有两个结构域与肝细胞生长因子（HGF）相似,这两个结构域被认为能促进成熟肝细胞的有丝分裂。DCP在血清和组织中的表达与肝癌的恶化程度及血管侵袭程度密切相关。在我们前期的研究中发现DCP能够促进人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）的增殖与转移。本课题主要研究DCP对人肝癌细胞增殖与转移的影响及细胞信号传导通路。试验方法DCP促进肝癌增殖、转移机制研究：选用人肝癌细胞株HLE及SK-Hep,两种细胞株均不产生DCP。CCK-8法检测DCP对肝癌细胞增殖的影响；AnnexinV/PI双染法检测肝癌细胞凋亡率；Transwell chamber法检测DCP对肝癌细胞侵袭的影响；明胶酶谱法（Gelatin zymography）检测DCP对肝癌细胞基质金属蛋白酶（MMPs）活力的影响；Western blot法检测DCP对肝癌细胞MMPs、p-Met、EGFR、p-EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c-Raf表达水平的影响；进一步试验采用PD98059阻断ERK1/2MAPK信号传导通路,Western blot法检测DCP对肝癌细胞生成MMPs的影响。ELISA法和Western-blot法检测DCP对肝癌细胞生成促血管生成因子的影响。维生素K2（VitK2）对肝癌增殖和侵袭作用研究：选用人肝癌细胞株PLC/PRF/5和HepG2, Western blot法检测维生素K2对肝癌细胞生成DCP的影响,MTT法检测维生素K2对肝癌细胞增殖的影响；Transwell chamber法检测维生素K2对肝癌细胞侵袭的影响。试验结果DCP促进肝癌细胞增殖、侵袭并激活ERK1/2MAPK细胞信号传导通路：CCK-8法检测发现DCP能够显著促进肝癌细胞HLE和SK-Hep的增殖,与正常凝血酶原对照组比较有显著性差异。160ng/ml浓度DCP孵育48h,HLE细胞增殖最高达到51.2%；AnnexinV/PI双染法检测发现DCP能够对抗erlotinib诱导的HLE细胞凋亡；明胶酶谱法检测发现DCP能够增强肝癌细胞HLE和SK-Hep生成的MMPs活力,同时Transwell chamber法检测发现DCP能够促进肝癌细胞穿过人工基底膜；Western blot法检测发现DCP能够提高肝癌细胞MMPs、p-Met、p-EGFR、EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c-Raf的表达水平；同时ERK1/2MAPK信号传导通路特异性阻断剂-PD98059能够抑制DCP诱导肝癌细胞HLE和SK-Hep表达MMPs,50μM的PD98059即有明显抑制作用,80μM的PD98059几乎完全抑制了MMPs的表达。提示DCP诱导MMPs表达作用与ERK1/2MAPK信号传导通路有关。ELISA法和Western blot法检测发现DCP能够促进血管生成因子VEGF, TGF-α和bFGF的表达。维生素K2抑制肝癌细胞增殖和侵袭：Western blot法检测发现VitK2能够抑制肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2生成DCP,同时抑制细胞的增殖和侵袭能力：当VitK2浓度达到40μM,孵育120h,对PLC/PRF/5细胞的增殖抑制率最高达到48.2%,在HepG2细胞也观察到相似的抑制作用；2-40μM的VitK2能够明显抑制PLC/PRF/5细胞的侵袭能力,最高抑制率达到72.4%。结论DCP能够显著促进肝癌细胞的增殖和侵袭,其机制与DCP促进肝癌细胞生成MMPs有关。通过ERK1/2MAPK通路特异性阻断剂-PD98059阻断试验发现DCP通过EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信号传导通路调节肝癌细胞生成MMPS。另外,维生素K2能够通过抑制DCP的产生抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 1.DCP的生成
• 2.DCP的临床应用
• 3.DCP与Hcc之间的相关性
• 4.维生素K通过降低DCP水平抑制肝癌
• 5.前景展望
• 6.总结
• 第一章 DCP促进肝癌细胞增殖作用研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 CCK-8法检测肝癌细胞增殖
• 2.2 Annexin V/PI双染法检测肝癌细胞凋亡
• 2.3 Western Blot检测p-c-Met、p-EGFR和EGFR的表达水平
• 3. 数据处理
• 4. 结果
• 4.1 DCP促进肝癌细胞增殖
• 4.2 DCP抵抗erlotinib诱导的肝癌细胞凋亡
• 4.3 DCP促进p-c-Met、p-EGFR和EGFR的表达
• 讨论
• 第二章 DCP促进肝癌细胞侵袭作用及机制研究
• 第一节 DCP促进肝癌细胞基质金属蛋白酶表达及信号通路研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 Transwell chamber法检测肝癌细胞侵袭
• 2.2 明胶酶谱法检测MMPs活力
• 2.3 Western Blot检测MMPs的表达水平
• 2.4 Western Blot检测p-ERK1/2、p-MEK1/2、p-c-Raf的表达水平
• 2.5 Western Blot检测PD98059对MMPs表达水平的影响
• 3. 数据处理
• 4. 结果
• 4.1 DCP促进肝癌细胞侵袭
• 4.2 DCP增强MMPs活力
• 4.3 DCP促进MMPs表达
• 4.4 DCP激活ERK1/2 MAPK信号传导通路
• 4.5 DCP通过ERK1/2 MAPK信号传导通路调节肝癌细胞MMPs表达
• 讨论
• 第二节 DCP促进肝癌血管生成因子表达作用研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 ELISA法检测血管生成因子表达水平
• 2.2 Western Blot检测血管生成因子表达水平
• 3.数据处理
• 4.试验结果
• 4.1 DCP促进血管生成因子表达
• 4.2 DCP促进血管生成因子表达
• 讨论
• 2对肝癌抑制作用研究'>第三章 维生素K₂对肝癌抑制作用研究
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2对DCP表达水平的影响'>2.1 Western Blot检测VitK₂对DCP表达水平的影响
• 2.2 MTT法检测肝癌细胞增殖
• 2.3 Transwell chamber法检测肝癌细胞侵袭
• 3.数据处理
• 4. 结果
• 2抑制肝癌细胞DCP表达'>4.1 VitK₂抑制肝癌细胞DCP表达
• 2抑制肝癌细胞增殖'>4.2 VitK₂抑制肝癌细胞增殖
• 2抑制肝癌细胞侵袭'>4.3 VitK₂抑制肝癌细胞侵袭
• 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文
• 附录
• 学位论文评阅及答辩情况表