论文摘要
目的：探讨骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）的shRNA干扰质粒在大鼠慢性移植肾肾病（CAN）模型中对大鼠移植肾上皮细胞向间充质转分化（EMT）的作用。初步探讨OPN在慢性移植物肾病中的作用及机制。方法：建立大鼠CAN模型：F344和Lewis近交系大鼠作为供、受体，取供体的左肾作为供肾，双人双目显微镜下先摘除受体左肾，行供肾肾静脉与受体肾静脉行端端吻合，供肾肾动脉与受体肾动脉行端端吻合，供肾膀胱瓣与受体膀胱吻合，行原位异体肾移植。术后10d，切除受体右肾。所有大鼠均给予环孢素A（CsA）10天预防急性排斥反应，1.5mg/kg?d，予皮下注射给药。建立大鼠CAN模型。分组情况：以F344大鼠为供体，Lewis大鼠为受体，行原位异体肾移植术，建立大鼠CAN模型（Allo组），以Lewis大鼠做供、受体作为同系移植对照（Syn组）。以基于流体力学辅以电穿孔的肾脏基因转染方法转染质粒到移植肾（RNAi组）。采用阴性对照质粒作为对照（NC组）。共四十只大鼠，每组十只。于术后12周处死各组动物。取移植肾标本进行HE和马松染色，观察组织形态学变化。并采用Banff 97标准进行评分及统计分析。采用western印迹和免疫组织化学方法对移植肾组织α-SMA、E-Cadherin的表达进行观察。同时采用以上方法检测移植肾组织OPN的表达，并对其灰度比作统计分析。收集并检测大鼠血清肌酐、尿素氮、24小时尿蛋白定量。结果：1.大鼠CAN模型的建立：通过手术训练技术成熟后共进行100例手术，手术成功率85％，手术失败原因主要为吻合口出血及血栓形成。供体、受体手术时间分别为70±20、65±15min，热缺血时间1min左右,冷缺血时间为45±16min。2.肾移植术后12周，通过免疫组化及Western印迹方法检测移植肾OPN的表达发现，RNAi组OPN表达显著低于Allo组。Allo/NC组大鼠移植肾组织形态学符合慢性移植肾肾病改变。RNAi组移植肾形态学变化较Allo减轻。根据Banff 97评分标准，Allo组肾小管萎缩评分显著高于Syn组（1.6±0.81 vs 0.1±0.20），Allo组肾小管间质纤维化程度明显重于Syn组（2.1±0.78 vs 0.2±0.46），差异均有显著性（P＜0．01）；RNAi组移植肾组织可见较轻微的CAN表现，其间质纤维化及肾小管萎缩的评分分别为0.7±0.54、1.1±0.71，均显著低于Allo组（P＜0．05）；Allo、NC组之间Banff评分差异无统计学意义（P＞0.05）。免疫组化及western印迹结果显示，与Syn相比，Allo组主要在肾小管上皮及肾间质强表达α-SMA，而Allo组小管上皮E-Cadherin表达较对照组明显下降。与之相比，RNAi组α-SMA表达下调，E-Cadherin表达上调。3.肾移植术后12周，Allo组血清肌酐（Scr）明显高于Syn组（116.9±3.1 vs 64.6±5.7），差异有统计学意义（p<0.05）。RNAi组Scr较Allo组明显下降（79.4±3.2 vs 116.9±3.1）,差异有统计学意义（p<0.05）。结论：OPN在大鼠CAN模型移植肾中表达上调，OPN体内RNA干扰能够减少OPN在移植肾的表达。并且OPN的RNA干扰能缓解移植肾功能恶化，缓解移植肾的病理学改变，并能抑制移植肾小管上皮向间充质转分化（EMT）。结果提示OPN与CAN的发生有潜在相关性。体内对其RNA干扰能够对大鼠慢性移植肾肾病有一定的治疗作用。OPN可能通过促进肾小管上皮发生EMT途径影响CAN发病。
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标签：骨桥蛋白论文; 上皮向间充质转分化论文; 干扰论文; 电穿孔论文; 间质纤维化论文;