番茄景天庚酮糖-1，7-二磷酸酯酶基因的克隆及遗传转化

论文摘要

番茄（Lycopersicon esculentum）是我国主要的设施蔬菜,属于冷敏感和喜光植物。景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶（SBPase）位于Calvin循环的再生和同化阶段的分支点上,对维持Calvin循环中RuBP的再生以及碳源的流通具有十分重要的作用。尽管SBPase在植物体内含量很低,却是限制RuBP再生速率的关键酶。通过基因工程的手段提高光合酶的含量和活性,对改良作物的光合能力具有重要意义。本研究以番茄为试材,克隆SBPase基因,分析其在番茄中的内源表达特性和昼夜变化模式;构建正、反义表达载体,通过农杆菌介导转化番茄,获得了转基因植株,分析了SBPase对番茄生长发育及光合作用的影响及其影响机理。研究结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到SBPase基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA,命名为LeSBP（FJ959073）。该基因全长为1564 bp,ORF为1185 bp,编码394个氨基酸,分子量约为42.5 kDa。2.同源序列比较发现,番茄的SBPase氨基酸序列与黄瓜、桑树、拟南芥、菠菜、小麦、水稻和衣藻的同源性分别为83.80 %、85.03 %、80.05 %、80.71 %、76.65 %、78.45 %和61.31 %。在SBPase氨基酸序列中,有6个Cys（cysteine）是保守的,其中的2个Cys形成的CGGT（A/Q）C结构,是参与光调节反应的氧化还原活性位点。3.构建了原核表达载体pET-LeSBP,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中诱导表达。以诱导蛋白免疫小白鼠,制备抗血清。测得效价为1:500,可以用于番茄中SBPase蛋白的免疫分析。4. Real-time PCR和Western杂交结果显示,SBPase在番茄叶、茎和绿色果实中均有表达,以叶片中表达量最高,明显高于其他组织,在不含叶绿体的根中没有检测到该基因的存在;在不同叶位叶片中以中部功能叶（第8片展开叶）表达量最高,上位叶和下位叶表达量较低;第8片展开叶的Pn明显高于第1, 4, 12和16片展开叶,不同叶位叶片的Pn与SBPase基因表达量及活性的变化趋势一致;番茄功能叶片（第8片展开叶）的Pn和SBPase活性及其mRNA相对表达量呈现相同的日变化趋势,说明SBPase对番茄的光合作用具有重要的调控作用。5.将获得的LeSBP与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用Real-time PCR和Western杂交方法对具有卡那抗性的转基因番茄植株检测,结果显示,转正义基因植株中LeSBP在转录水平和蛋白水平过量表达,反义植株中基因发生沉默。6. LeSBP过量表达时,转正义番茄植株的SBPase活性与Pn明显提高,碳水化合物积累量增多,茎加粗,叶面积变大,干物重量及根/冠比增加,初花期比野生型提早57d;反义抑制LeSBP表达时,SBPase活性下降,Pn降低,茎变细,叶面积变小,生长缓慢,初花期延迟25 d。7.低温胁迫2 h,番茄叶片的LeSBP表达量及SBPase活性显著降低,Pn明显减小,Fv/Fm和фPSII变化不大。转正义番茄植株的Pn下降幅度和电解质渗漏率增加幅度明显小于野生型,Fv/Fm和фPSII与野生型差异不显著;而反义介导的LeSBP的缺失导致转反义番茄植株的Pn下降幅度和电解质渗漏率增加幅度明显大于野生型。可见LeSBP过量表达可减轻低温对番茄光合作用的影响,提高番茄的耐冷性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 卡尔文循环
• 1.2 景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酯酶（SBPase）
• 1.2.1 SBPase的结构
• 1.2.2 SBPase的性质与功能
• 1.2.3 SBPase基因克隆与表达调控
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 菌株与载体
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR引物
• 2.1.6 培养基（见附录）
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 总RNA 的提取
• 2.2.2 cDNA第一条链的合成
• 2.2.3 SBPase基因全长的克隆
• 2.2.3.1 中间片段的获得
• 2.2.3.2 3′RACE 获得3′端序列
• 2.2.3.3 5′RACE 获得5′端序列
• 2.2.3.4 全长cDNA的克隆
• 2.2.3.5 目的基因的回收
• 2.2.3.6 目的基因的连接与转化
• 2.2.3.7 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.3.8 序列分析
• 2.2.4 真核表达载体的构建
• 2.2.4.1 引物设计
• 2.2.4.2 表达载体构建
• 2.2.4.3 重组质粒的鉴定
• 2.2.5 农杆菌介导转化番茄
• 2.2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5.2 冻融法转化农杆菌
• 2.2.5.3 利用农杆菌介导转化番茄
• 2.2.6 转基因番茄植株的PCR检测
• 2.2.6.1 植株基因组DNA的提取
• 2.2.6.2 转基因植株的PCR筛选
• 2.2.7 原核表达载体的构建及Western 杂交
• 2.2.7.1 原核表达载体的构建
• 2.2.7.2 组氨酸标签融合蛋白的表达
• 2.2.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.7.4 蛋白的纯化
• 2.2.7.5 抗体的制备
• 2.2.7.6 抗血清效价的测定
• 2.2.7.7 Western杂交
• 2.2.8 实时荧光定量PCR
• 2.2.8.1 反转录反应
• 2.2.8.2 基因表达
• 2.2.9 SBPase活性的测定
• 2.2.10 转基因番茄生长和生理指标的测定
• 2.2.10.1 生长指标
• 2.2.10.2 光合速率、最大光合速率和RuBP再生速率
• 2.2.10.3 叶绿素荧光参数
• 2.2.10.4 淀粉含量
• 2.2.10.5 可溶性糖含量
• 2.2.10.6 电解质渗漏率
• 2.3 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄SBPase基因的分离及序列分析
• 3.1.1 LeSBP的分离
• 3.1.2 LeSBP的序列分析
• 3.2 LeSBP的表达分析
• 3.2.1 LeSBP在大肠杆菌中的表达
• 3.2.1.1 原核表达载体pET-LeSBP的构建
• 3.2.1.2 组氨酸标签融合蛋白的表达
• 3.2.2 LeSBP在番茄中的表达特性
• 3.2.2.1 LeSBP在番茄不同组织中的表达
• 3.2.2.2 LeSBP在番茄不同叶位叶片中的表达
• 3.2.2.3 番茄功能叶片的LeSBP 表达昼夜变化
• 3.2.2.4 番茄叶片的净光合速率
• 3.3 LeSBP在番茄中的遗传转化
• 3.3.1 正、反义表达载体的构建
• 3.3.2 正、反义表达载体的鉴定
• 3.3.3 转正、反义LeSBP植株的分子鉴定
• 3.4 LeSBP过量表达对番茄光合作用及生长发育的影响
• 3.4.1 转正义LeSBP番茄叶片的SBPase活性
• 3.4.2 LeSBP过量表达对番茄光合速率的影响
• 3.4.3 LeSBP过量表达对番茄碳水化合物含量的影响
• 3.4.4 LeSBP过量表达对番茄生长发育的影响
• 3.4.4.1 对株高和茎粗的影响
• 3.4.4.2 对叶片大小的影响
• 3.4.4.3 对生物量的影响
• 3.4.4.4 对初花期的影响
• 3.5 LeSBP的缺失对光合作用及生长发育的影响
• 3.5.1 转反义LeSBP番茄叶片的SBPase活性
• 3.5.2 LeSBP缺失对番茄叶片光合速率的影响
• 3.5.3 LeSBP缺失对番茄叶片碳水化合物含量的影响
• 3.5.4 LeSBP缺失对番茄生长发育的影响
• 3.5.4.1 对株高和茎粗的影响
• 3.5.4.2 对叶片大小的影响
• 3.5.4.3 对生物量的影响
• 3.5.4.4 对初花期的影响
• 3.6 转基因番茄植株的耐冷性分析
• 3.6.1 LeSBP过量表达对番茄耐冷性的影响
• 3.6.1.1 低温下正义植株LeSBP 表达和SBPase活性变化
• 3.6.1.2 低温下正义番茄植株叶片光合速率的变化
• 3.6.1.3 低温下正义植株RuBP再生速率的变化
• 3.6.1.4 低温下正义番茄植株叶片光化学效率的变化
• 3.6.1.5 低温下正义番茄植株叶片电解质渗漏率的变化
• 3.6.2 LeSBP的缺失对番茄耐冷性的影响
• 3.6.2.1 低温下反义植株LeSBP 表达和SBPase活性的变化
• 3.6.2.2 低温下反义番茄植株叶片光合速率的变化
• 3.6.2.3 低温下反义植株RuBP再生速率的变化
• 3.6.2.4 低温下反义番茄植株叶片光化学效率的变化
• 3.6.2.5 低温下反义番茄植株叶片电解质渗漏率的变化
• 4 讨论
• 4.1 番茄LeSBP 的基因序列特征
• 4.2 日光温室番茄SBPase活性及基因表达特性与光合速率的关系
• 4.3 过量表达LeSBP可提高番茄的光合功能及生长速率
• 4.4 LeSBP 的缺失抑制番茄光合作用和生长发育
• 4.5 LeSBP 过量表达可提高番茄的低温耐性
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 博士学位论文内容简介及自评