论文摘要
卵巢恶性肿瘤中上皮性癌最多见,居女性生殖道恶性肿瘤死因的首位。疾病的进展和病情的加重主要是由于局部腹膜播散而非血液转移所致。尽管目前卵巢癌联合治疗的手段包括手术治疗、化疗和放疗有所进展,但5年存活率始终徘徊在25%～30%。随着肿瘤生物学和分子遗传学的进展,人们逐渐认识到:和人体其他部位的肿瘤一样,卵巢癌发生发展主要是原癌基因的激活与抑癌基因的突变失活并由此产生一系列基因异常和动态演进的结果。研究显示PI3K/Akt通路与肿瘤的发生发展密切相关,AKT在肿瘤细胞的增殖和侵袭性生长中发挥关键作用。但到目前为止,IA型P13K/Akt通路在卵巢癌中的表达及其在肿瘤恶性进展中的作用尚未深入研究。因此,本课题首先从PI3K/Akt信号通路相关基因的蛋白表达研究入手,然后进行靶向PI3K/Akt的RNAi干预卵巢癌的体外试验,最后应用基因芯片技术筛选相关基因敲除后基因表达谱的差异基因,并应用系统生物学的概念进行差异基因的综合分析,以期进一步了解PI3K/Akt信号通路在卵巢癌中的作用以及阻断该通路对卵巢癌恶性进展的影响。课题分三部分进行:第一部分:应用组织芯片技术结合免疫组化检测IA型PI3K/Akt通路主要成员PI3Kp85α、AKT1、AKT2和Ki67在卵巢癌中的表达状况,并进一步在表达水平分析了PI3Kp85α、AKT1、AKT2和Ki67之间的相关关系及其与卵巢癌恶性程度之间的联系。第二部分:在体外应用RNA干涉技术以oligofectamine介导siRNA分别靶向PⅠ3Kp85α和AKT1转染人卵巢癌细胞系SKOV3后,应用Realtime PCR检测目的基因PI3Kp85α、AKT1的敲低情况,并用Western blot和免疫荧光技术检测RNAi敲低PI3Kp85α、AKT1的表达后,IA型PI3K/Akt通路主要成员PIBKp85α、AKT1、AKT2和Ki67的表达变化;MTT法和annexin V标记评价细胞的增殖活性和凋亡,流式细胞法分析细胞周期,Transwell法分析侵袭能力。第三部分:应用Oligo荧光交换基因芯片技术对相关基因敲除后卵巢癌细胞系SKOV3基因表达谱的差异基因的进行筛选,并应用生物信息学检索对相关基因和信号通路进行综合分析。结果第一部分:PI3K-AKT1-AKT2-Ki67的表达及分析组织芯片结合免疫组化技术显示IA型PI3K/Akt通路中PI3Kp85α、AKT1、AKT2和Ki67在卵巢癌癌中均呈高表达,其表达水平随肿瘤的演进程度及恶性程度增加而明显上升;此外相关分析发现PI3Kp85α、AKT1、AKT2和Ki67之间存在着显著性的关系。上述研究结果表明:PI3K/Akt通路对卵巢癌的恶性进展作用显著,激活这条通路可以促进肿瘤细胞增殖和侵袭这两种重要的恶性表型。阻断PI3K/Akt通路可以成为阻止卵巢癌进展的关键策略,因而PI3Kp85α、AKT1、AKT2可能是卵巢癌基因治疗的侯选基因。第二部分:体外研究Realtime PCR结果提示,转染PI3Kp85αsiRNA后可明显敲低PI3Kp85αmRNA的表达;转染AKT1 siRNA后可明显敲低AKT1 mRNA的表达。Westernblot和免疫荧光检测发现除PI3Kp85α、AKT1的蛋白明显敲低外,AKT2和Ki67的表达水平亦均明显降低（P＜0.01）。siRNA分别靶向PI3Kp85α、AKT1转染后卵巢癌细胞增殖能力明显受到抑制,并可诱发细胞凋亡,细胞周期分析表明出现G0/G1阻滞,细胞的运动迁移能力降低（P＜0.01）,侵袭能力减弱（P＜0.01）。第三部分:AKT1基因敲除后基因表达谱的改变siRNA靶向敲除AKT1后,基因芯片技术分析人卵巢癌细胞系SKOV3基因表达谱的变化,发现有21条基因表达明显下调,16条基因表达明显上调;检索KEGG、BioCarta和GenMAPP数据库共38条Pathway显著相关;15条基因与分子功能显著相关,15条基因与生物学进程显著相关,18条基因与细胞组分显著相关。结论:1.卵巢癌组织中PI3Kp85α、AKT1、AKT2和Ki67过表达,表达水平与卵巢癌的临床分期和组织学分级成正相关,提示在卵巢癌中存在IA型PI3K/Akt信号通路,这条通路与卵巢癌的增殖和侵袭密切相关。2.体外实验显示siRNA靶向敲除PI3Kp85α和AKT1可阻断卵巢癌细胞的增殖和侵袭,阻滞细胞周期,并诱发细胞凋亡。3.siRNA靶向敲除人卵巢癌细胞系SKOV3 AKT1基因后,应用基因芯片技术按2倍标准筛选差异表达基因,生物信息数据库检索结果显示21条基因表达显著下调,16条基因表达显著上调;与38条信号通路显著相关;与分子功能、生物学进程和细胞组分相关的基因分别为15条、15条和18条。相关信息有待于应用系统生物学的方法进一步分析和深入研究。4.PI3K/Akt通路的研究为治疗提供了很大空间,PI3Kp85α和AKT1可成为卵巢癌基因治疗的重要优选靶的,而PI3K和AKT抑制剂有望成为卵巢癌的有效化疗药物。