粗毛栓菌atp9基因的克隆、原核表达及进化分析

论文摘要

粗毛栓菌作为一种白腐真菌,可以有效地降解自然界中广泛存在的木质素,在环境保护和资源再生领域都有着相当广泛的应用前景。在生物体内,ATP合酶是能量代谢的关键酶,参与生命体中的多种光合磷酸化以及氧化磷酸化反应。其中atp9基因的功能是负责编码ATP合酶A亚基上的第9亚单位,是编码ATP合酶基因的重要组成部分,这部分基因片段的功能与呼吸作用和光合作用有相当密切的关联。由于atp9基因在进化过程中高度保守,本研究根据已知近缘真菌的基因序列,设计并合成了一对引物,由粗毛栓菌的mRNA反转录从而得到cDNA,以此第一链作为模板,利用PCR技术得到粗毛栓菌的编码部分ATP合酶的atp9基因的完整序列,并将其连接于已处理好的原核表达载体上。此后进行了一系列的测序与进化分析的结果表明：该克隆片段全长222个碱基对,一共编码了73个氨基酸,其翻译的蛋白质的分子量为7.35kD。转化大肠杆菌后经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导,能够快速且高效地表达所需的外源融合蛋白,其产物的分子量大小与预测结果对比一致。经过同源比对和进化树分析,该克隆基因编码的氨基酸序列与拉丁名为Crinipellis perniciosa和Trametes cingulata strain ATCC26747的可可丛枝病菌、瓣环栓菌的相似度最高。本实验为未来进一步研究粗毛栓菌atp9基因和其编码的蛋白功能以及阐释其调控和作用机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1. 木质素降解真菌
• 1.1.1 木质素降解酶
• 1.1.2 粗毛栓菌
• 1.2 ATP合酶
• 1.3 目的基因的反转录及原核表达
• 1.3.1 目的基因的反转录
• 1.3.2 转录产物的原核表达系统
• 1.4 目的蛋白的检测
• 1.4.1 蛋白质形貌特点的检测方法
• 1.4.1.1 扫描电子显微镜
• 1.4.1.2 透射电子显微镜
• 1.4.1.3 原子力显微镜
• 1.4.2 外源目的蛋白结构特点的检测
• 1.4.2.1 动态光散射
• 1.4.2.2 傅立叶变换红外光谱扫描
• 1.4.2.3 圆二色谱
• 1.5 分子进化分析与系统发育研究
• 1.5.1 系统发育研究
• 1.5.2 种系树的构建与分析
• 2. 材料与方法
• 2.1 供试菌株与主要实验设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验用主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.1.4.1 蛋白质电泳相关溶液
• 2.1.4.2 LB液体培养基
• 2.1.4.3 LB固体培养基
• 2.1.4.4 层析缓冲溶液
• 2.1.4.5 其他
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 合成cDNA第一链
• 2.2.3 构建原核表达质粒
• 2法制备感受态细胞'>2.2.4 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.2.5 目的基因在E.coli中的诱导表达
• 2.2.6 表达产物的鉴定
• 2.2.7 色谱法纯化目的蛋白
• 2.2.8 镍螯合层析
• 2.2.9 构建分子进化树
• 3 实验结果
• 3.1 apt9基因的克隆
• 3.2 原核表达结果
• 3.3 atp9基因的进化分析
• 3.4 ATPase 9的同源序列比对
• 4 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 研究生在校期间的科研成果