小麦白粉菌群体对三唑酮和嘧菌酯的敏感性测定及其抗性基因突变位点的分子检测

论文摘要

采用小麦拌种离体叶段法分别测定了采自我国7个省(市)的小麦白粉菌的110和130个单孢堆分离物对三唑酮和嘧菌酯的敏感性。实验结果表明,所供试的110个菌株对三唑酮的平均抑制中浓度(EC50)为118.24 mg/L,平均抗性水平为56.58倍,病菌群体中有99.09%的菌株已经产生了抗性,其中高抗菌株(抗性水平>40)占49.09%,中抗菌株(10<抗性水平≤40)47.27%。从抗性水平的分布来看,各省(市)除湖北省仅有一个敏感菌株外其它各地均全部为抗性菌株;高抗菌株所占比例较高的来自甘肃和河北,分别为91.67%和80.00%,其次是北京、四川和陕西,分别为71.43%、66.67%和31.25%,所占比例较小的来自河南和湖北,分别为11.11%和6.25%。对所供试菌株的嘧菌酯的敏感性测定结果显示,尽管不同地区及不同菌株间还存在差异,但病菌群体的敏感性频率符合正态分布,故其群体的CE50平均值定为敏感基线41.03 mg/L。研究还发现,嘧菌酯与三唑酮之间无交互抗性。该研究结果为小麦白粉病的化学防治及农药的合理使用提供依据。在小麦白粉菌对三唑类和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂抗性突变位点的分子检测方面,根据白粉菌对嘧菌酯产生抗性与细胞色素(cyt b)基因发生突变有关,对供试的81个菌株的cyt b基因与抗性相关的重要序列进行了测序分析,结果显示,在供试的不同抗性水平的菌株中均未发现突变位点;根据白粉菌对三唑酮产生抗性与CYP51基因有关,通过398位氨基酸的突变,设计了抗性特异性引物,建立了此位点的PCR分子检测体系,并利用抗性引物对55个不同抗性水平的菌株进行了检测,结果发现敏感和低抗菌株均未扩增出目标条带,中抗和高抗菌株的出带率分别为8.33%和41.38%,此研究对了解白粉菌对三唑类和甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦白粉病简介
• 1.1.1 小麦白粉病的症状
• 1.1.2 小麦白粉病病原菌的生物学特性
• 1.1.3 小麦白粉病的发生、分布和危害
• 1.1.4 小麦白粉病的化学防治
• 1.2 小麦白粉菌的抗药性概述
• 1.2.1 抗药性的概念
• 1.2.2 抗药性产生的原因
• 1.3 禾谷白粉菌对DMIs 类杀菌剂的抗药性研究概述
• 1.3.1 国内外对小麦白粉病菌的抗药性研究
• 1.3.2 病原真菌对DMIs 类杀菌剂产生的抗性的机理
• 1.4 禾谷白粉菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性研究概述
• 1.4.1 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性研究现状
• 1.4.2 甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的分子抗性机理
• 1.5 分子生物学技术在病原菌抗药性检测上的应用
• 1.5.1 等位基因特异性扩增（Allele-specific Amplification，ASA）
• 1.5.2 等位基因的特异性寡核苷酸杂交（Allele-specific Oligonucleotide Hybridization，ASOH）
• 1.5.3 限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP）
• 1.5.4 实时定量PCR （Quantiative Real-time PCR）
• 1.5.5 变性高效液相色谱分析（ Denaturing High-Performance Liquid Chromatography，DHPLC）
• 1.6 研究意义
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 小麦白粉病菌对三唑酮和嘧菌酯的敏感性测定实验
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.1.3 调查记录
• 2.1.4 数据分析
• 2.2 小麦白粉菌基因组总DNA 提取
• 2.2.1 供试材料
• 2.2.2 所用试剂
• 2.2.3 试验方法
• 2.3 小麦白粉菌群体CYP51 基因对应氨基酸389 位点突变频率的分子检测
• 2.3.1 供试材料
• 2.3.2 试验方法
• 2.4 小麦白粉病菌群体细胞色素b（cyt b）部分基因的测序分析
• 2.4.1 供试材料
• 2.4.2 试验试剂
• 2.4.3 PCR 反应
• 第三章 结果与分析
• 3.1 小麦白粉菌对三唑酮及嘧菌酯的敏感性测定
• 3.1.1 我国主要麦区白粉病菌群体对三唑酮的敏感性
• 3.1.2 小麦白粉菌对嘧菌酯敏感基线的建立
• 3.1.3 麦白粉菌对三唑酮和嘧菌酯的交互抗性研究
• 3.2 我国部分麦区白粉病菌总DNA 的提取
• 3.3 小麦白粉菌群体中CYP 51 基因对应氨基酸398 突变位点分子检测
• 3.3.1 特异性引物的设计和筛选
• 3.3.2 PCR 检测结果
• 3.3.3 CYP51 基因对应氨基酸398 位点的分子检测体系
• 3.3.4 CYP51 基因对应氨基酸398 位点的抗性频率计算
• 3.4 小麦白粉病菌群体细胞色素b（cyt b）部分基因序列测序分析
• 3.4.1 小麦白粉菌cyt b 基因部分序列电泳检测结果
• 3.4.2 小麦白粉菌cyt b 基因部分序列测序结果
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 小麦白粉菌对三唑酮和嘧菌酯的敏感性测定
• 4.2 小麦白粉菌CYP51 基因对应氨基酸398 突变位点的分子检测
• 4.3 小麦白粉菌对嘧菌酯抗性基因位点的序列分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介