利用基因芯片技术筛选矽肺纤维化相关基因的体外实验研究

论文摘要

矽肺是发病率高、死亡危险性大、对劳动者危害严重的一类职业病,其患者人数已经达到我国职业病患者总数的三分之二。研究表明,矽肺的形成是众多细胞和分子共同参与的复杂过程。在此过程中,相关基因扮演着不同的角色,但它们之间又可以相互协调,进而影响矽肺的发生与发展。因此我们可以把这些相关基因作为一个整体,利用先进的分子生物学技术研究矽肺的发生、发展过程,筛选出调控该过程的关键基因,揭示在基因水平上矽肺发病的本质,这对明确其分子机制及研究新的防治手段具有深远的意义。王献华教授长期从事矽肺纤维化分子病理学的研究,相继开展了白细胞介素-lβ（interleukin-lβ, IL-lβ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）、核因子-κB（nuclear factor-kappaB, NF-κB）、血小板源性生长因子（platelet- derived growth factor, PDGF）等因子与矽肺纤维化关系的研究,结果表明基因的表达在矽肺发生发展过程中的确有所变化。但这些研究大部分是对某一个或几个基因的单独分析,不能全面地显示基因的差异与矽肺的关系。测定基因组序列工作的完成,意味着人类进入了后基因组时代,对基因的研究重点也从基因的发现转变为基因功能的发现。基因芯片技术可以对基因表达差异进行高通量、大规模的分析,所以我们可以利用此技术对矽肺发病过程中的完整基因表达谱进行比较研究,从而筛选出矽肺纤维化相关基因。本研究在河北省自然科学基金的资助下,利用博奥生物有限公司的35K人类全基因组寡核苷酸芯片,初步筛选出了与人矽肺纤维化发病相关的候选差异表达基因,并结合生物信息分析工具对差异表达基因进行生物信息学分类。目的1对矽肺体外细胞模型肺成纤维细胞与正常肺成纤维细胞的基因表达谱进行比较研究,从而筛选出差异表达基因。2对差异基因进行生物信息学分类。3检验上调基因IGFBP-5和下调基因MMP-3在矽肺体外细胞模型中的表达,从而验证基因芯片结果的可靠性。方法1筛选矽肺纤维化相关的差异表达基因1.1采用体外细胞培养方法,选用矽肺患者支气管肺泡灌洗液（broncho- alveolar lavage fluid, BALF）中的肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages,AM）、人外周血单核细胞株（THP-1）和人胚肺成纤维细胞株（HFL-I）作为实验研究材料。1.2收集矽肺患者BALF中的AM,用含SiO2（50μg/ ml）的培养基刺激18 h后收集条件培养上清。1.3用含佛波酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA）160nmol/L的培养基刺激THP-1 48h,诱导成功后换成空白培养基培养18h后收集上清。1.4实验分两组:利用AM条件上清,与HFL-I共同孵育建立矽肺体外细胞模型（S组）;利用PMA诱导的THP-1上清,与HFL-I共同孵育建立正常肺体外细胞模型（C组）。1.5将两组条件上清与HFL-I共同孵育36h后,提取两组HFL-I总RNA,送往博奥生物有限公司筛选两组的差异基因。2差异基因生物信息学分类:运用MAS3.0系统对差异基因进行生物信息学分类。3利用免疫细胞化学、Western-blot和RT-PCR技术验证基因芯片的部分结果3.1采用免疫细胞化学法和Western-blot法验证IGFBP-5和MMP-3蛋白在两组中的表达情况,孵育时间点为6h、12h、24h、36h、48h、72h。3.2采用RT-PCR技术验证IGFBP-5和MMP-3 mRNA在两组中的表达情况,孵育时间点为6h、12h、24h、36h、48h、72h。4应用自动图像分析系统对免疫细胞化学、Western-blot和RT-PCR结果进行半定量分析,应用SPSS13.0软件,采用t检验对结果进行统计学分析。结果1差异基因表达谱结果:对基因芯片所得数据进行分析,获得有效基因8999条,差异基因84条,其中43条上调基因和41条下调基因。2差异表达基因的生物信息学分类结果:依据MAS3.0系统中GO数据库提供的3种本体论（分子功能、生物学过程、细胞组分）对差异基因进行GO分类,得到107个功能簇,主要涉及细胞骨架、细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导、细胞分化和增殖等分子功能;依据MAS3.0系统中的KEGG数据库对差异基因涉及的生物学通路进行分类,得到31条信号传导通路,主要涉及Jak-STAT信号通路、PPAR信号通路、肾素-血管紧张素系统、P53信号通路、TGF-β信号通路、Toll样受体信号通路、钙信号通路等。3免疫细胞化学、Western-blot和RT-PCR技术验证基因芯片部分结果3.1 IGFBP-5蛋白及mRNA在矽肺体外细胞模型肺成纤维细胞及正常成纤维细胞中的表达:IGFBP-5蛋白及mRNA在两组中的表达,12h以后各个时间点S组均高于C组,差异有统计学意义（p<0.05）。结果与芯片结果吻合。3.2 MMP-3蛋白及mRNA在矽肺体外细胞模型肺成纤维细胞及正常成纤维细胞中的表达:MMP-3蛋白及mRNA在两组中的表达,12h以后各个时间点S组均低于C组,差异有统计学意义（p<0.05）。结果与芯片结果吻合。结论1本研究利用基因芯片技术对矽肺纤维化基因表达谱进行研究,这在国内外实属罕见,筛选出的差异表达基因84条,其中43条上调,41条下调,说明在矽肺的发生发展过程中存在多基因表达异常,这些差异基因为研究肺纤维化分子机制提供了大量有价值的信息。2系统水平上的功能分类和信号通路分析,可能会有助于从系统生物学的角度对矽肺的发生和发展进行再认识。3从差异表达基因的筛选结果中选取上调基因IGFBP-5和下调基因MMP-3,运用免疫细胞化学、Western-blot和RT-PCR技术验证二者在两组中的蛋白和基因表达,结果与基因芯片结果基本吻合,进一步证实基因芯片结果的可靠性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 展望与不足
• 附图
• 参考文献
• 综述 基因芯片技术在肺纤维化研究中的应用
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历