液体发酵生产桦褐孔菌菌丝体及活性成分的研究

论文摘要

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）,是珍稀的大型药用真菌,在俄罗斯已有一百多年的应用历史,能治疗多种疾病。具有抗肿瘤、降血糖、抗病毒、增强免疫和抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。为得到大量桦褐孔菌菌体及活性成分,本论文首先从实验室保存的两株菌株中确定了一株出发菌株,研究了高产胞内、外多糖的液体培养条件,并对胞内多糖和三萜化合物提取工艺进行了研究,最后对多糖的性质进行初步的鉴定。结果如下:1.通过对桦褐孔菌W和D菌株的筛选,发现D菌株生长快,菌丝致密,多糖产量高,同时对其菌落形态和菌丝形态进行了比较,确定菌株D为出发菌株。并且通过正交试验得到桦褐孔菌D菌株的液体发酵最佳培养基组成为:葡萄糖2.5%,麸皮0.7%,玉米粉0.8%,黄豆粉1%,酵母粉0.4%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.05%,培养基的起始pH6.0。最佳液体摇瓶培养条件为:培养温度28℃,装液量100 mL/250 mL,接种量10%（V/V）,转速为160 r/min,最佳培养时间10天。在此培养条件下桦褐孔菌菌体为蓬松、绒毛状的菌球,并且有利于菌体生长和多糖代谢,其最大菌体干重、胞外多糖、胞内多糖分别为41.12 g/L、5.95 g/L、2.93 g/L。2.正交试验优化得到了胞内多糖最佳的提取条件为:水料比40∶1,提取温度80℃,提取时间2 h,提取次数2次,3倍体积的75%乙醇沉淀,醇沉温度4℃时,此时胞内多糖提取率为59.5 mg/g。另外通过单因素试验确定了桦褐孔菌三萜化合物的最佳提取工艺参数为:提取溶剂采用异丙醇,溶剂用量为80 mL/g,提取时间为2 h,提取温度为80℃。桦褐孔菌三萜最高提取率达到8.85%。3.对桦褐孔菌胞内、外多糖的性质进行了初步鉴定,其中胞内总糖含量为59.95%、肽含量为23.81%,单糖含量0.26%;胞外总糖含量为62.86%、肽含量24.51%、单糖含量0.31%。经HPGFC检测到桦褐孔菌胞内、外多糖的有效成分峰的分子量分别为762.801 KDa和953.005 KDa,归一化含量分别为78.56%和62.23%。桦褐孔菌胞外多糖和胞内多糖中都含有17种氨基酸,其中必需氨基酸含量分别占氨基酸总量的19.23%和16.60%。在这17种氨基酸中,含量均以谷氨酸最高,天冬氨酸次之。在190400 nm区间进行紫外扫描,胞内、胞外多糖均出现蛋白结合多糖的特征。通过红外光谱分析,均具有α-和β-类型的糖苷键。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 药（食）用真菌的生物学特性
• 1.3 药用真菌的培养研究
• 1.4 药（食）用真菌多糖
• 1.4.1 真菌多糖的代谢调控
• 1.4.2 真菌多糖的结构
• 1.4.3 真菌多糖的活性与构效关系
• 1.5 桦褐孔菌的研究
• 1.5.1 桦褐孔菌简介
• 1.5.2 桦褐孔菌的研究现状及应用前景
• 1.5.3 桦褐孔菌的药用价值及化学成分
• 1.5.4 桦褐孔菌多糖的分离提取
• 1.5.5 结构分析
• 1.6 本课题研究的意义
• 1.7 本课题研究的主要内容
• 第二章 桦褐孔菌的菌体形态与多糖代谢产量关系的研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 实验仪器
• 2.2.4 培养基
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 桦褐孔菌菌种的复壮
• 2.3.2 桦褐孔菌的培养特性
• 2.3.3 菌丝体形态观察
• 2.3.4 菌球直径的确定
• 2.3.5 菌丝体干重的测定
• 2.3.6 还原糖的测定方法
• 2.3.7 总糖的测定方法
• 2.3.8 多糖含量的计算
• 2.3.9 胞内多糖的提取
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 出发菌株的筛选
• 2.4.2 营养因子对桦褐孔菌的菌丝形态与多糖代谢产量的影响
• 2.4.3 正交试验确定最优培养基
• 2.4.4 正交试验验证试验
• 2.4.5 非营养因子对桦褐孔菌的菌丝形态与多糖代谢产量的影响
• 2.4.6 桦褐孔菌液体培养代谢曲线
• 2.4.7 桦褐孔菌深层培养的菌球的生长
• 2.4.8 桦褐深层培养的菌体形态结构和多糖产量之间的关系
• 2.5 本章小结
• 第三章 桦褐孔菌活性成分提取工艺研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 主要材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 桦褐孔菌胞内多糖分析测定方法
• 3.2.4 桦褐孔菌胞内三萜化合物的分析测定方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 桦褐孔菌胞内多糖提取工艺优化
• 3.3.2 三萜化合物标准曲线
• 3.3.3 不同提取条件对三萜化合物提取率的影响
• 3.4 本章小结
• 第四章 桦褐孔菌多糖性质的初步鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 多糖的理化性质
• 4.3.2 多糖的分子量
• 4.3.3 红外光谱分析桦褐多糖的结构
• 4.3.4 紫外光谱分析桦褐孔菌多糖
• 4.3.5 桦褐孔菌多糖氨基酸含量分析
• 4.4 本章小结
• 第五章 主要结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读研究生期间发表的论文