海洋放线菌的分离、耐药性诱变及抗菌活性研究

论文摘要

海洋放线菌由于可能代谢多种结构新颖的活性化合物,在药物开发领域越来越受到重视。为发现具有农用活性的新抗生素,本论文从农药学角度对96株海洋放线菌进行了系统研究,主要工作包括:放线菌的分离、筛选、菌株诱变选育、菌株鉴定、发酵条件优化、活性成分分离及代谢产物抑菌活性评价,现将结果总结如下。（1）从海水和海泥样品中分离得到96株放线菌,通过抑菌活性筛选到一株具有良好抑菌活性的放线菌菌株,编号为B3。活性测定表明,菌株B3发酵液对苹果轮纹病菌（Macrophoma kawatsukai）、烟草赤星病菌（Alternaria longipes）的菌丝生长抑制作用显著,EC50值均小于10mL·L-1 ;对蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）的抑菌圈直径分别为22.67mm、23.33mm和19.00mm。盆栽试验表明,菌株B3发酵原液对小麦白粉病（Blumeria graminis）的保护和治疗效果分别为98.67%和76.93%。通过捷克八溶剂系统纸色谱测定菌株B3发酵液中主要活性成分为碱性水溶性抗生素。采用ESI-MS/MS对发酵液的活性成分进行分析,结果表明主要的活性成分为链丝菌素类化合物,通过MS/MS谱图和母离子碎片峰信息,以及与标准化合物质谱图进行对比,鉴定其中4个化合物为N-乙酰化链丝菌素D、链丝菌素F、N-乙酰化链丝菌素C和链丝菌素D。（2）以12株不表现或微弱表现生物活性的野生海洋放线菌菌株为出发菌株,引入链霉素、庆大霉素、利福平对其分别进行单独耐药性诱变和复合抗生素耐药性诱变,获得858株耐药突变菌株。以6种病原真菌和5种病原细菌为供试菌,采用抑制菌丝生长速率法和管碟法测定耐药突变菌株发酵产物的抑菌活性,筛选到3株具有抑菌活性的耐药突变菌株,编号为J22-G6、E6-S6、E7-G1。传代试验结果表明:耐药突变菌株J22-G6具有强烈的抗细菌活性和较好的传代稳定性。菌株J22-G6对5种供试病原细菌的抑菌圈直径均在22mm以上,而且抑菌圈透明。（3）对野生菌株J22和耐药突变菌株J22-G6进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分及16SrDNA序列的研究。培养特征表明:野生菌株J22与突变菌株J22-G6在不同的培养基上的生长状况和形态特征基本相同,但在菌丝颜色、生长速率上有明显差异。野生菌株J22和突变菌株J22-G6生理生化特征上存在差异不大,只有在碳源利用上,菌株J22不可以利用肌醇做碳源,而菌株J22-G6能有效的利用肌醇做碳源。野生菌株J22与突变菌株J22-G6的细胞壁类型均为I型,糖型C型;从16SrDNA序列上看,野生菌株与突变菌株的基因序列上均未发现任何碱基变异。对菌株16SrDNA序列分析,结合形态特征与生理生化特征的分析,初步鉴定菌株J22属于Streptomyces anulatus,暂命名为Streptomyces anulatus J22。（4）对菌株J22-G6的发酵条件进行了优化研究,确定了其最佳培养基组成及培养条件。通过单因子试验、P-B试验和中心复合试验确定菌株J22-G6的最佳摇瓶发酵培养基配方为:小米10 g/L、乳糖20g/L、牛肉膏3g/L、NaCl 2.5 g/L、CaCO3 2 g/L,最佳发酵条件pH值7.0,装液量为50mL,接种量为6×07cfu/mL,发酵时间为145h。（5）研究了菌株J22-G6的代谢产物。通过捷克八溶剂系统纸色谱测定菌株J22-G6发酵液中主要活性成分为水溶性抗生素。采用大孔吸附树脂、CM-Sephadex- C25离子交换凝胶层析、高效液相色谱制备等技术对活性组分进行了分离纯化,得到一个活性化合物F4,采用高分辨质谱及超导核磁共振谱等初步推断该化合物为聚醚类化合物。生测结果表明该化合物对部分革兰氏阳性细菌有强烈的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 抗生素的筛选途径
• 1.1.1 生态学途径
• 1.1.2 遗传学途径
• 1.2 利用微生物耐药性诱变育种
• 1.2.1 微生物对抗生素的耐药机制
• 1.2.2 抗生素耐药性诱变原理
• 1.2.3 利用微生物耐药性诱变育种概况
• 1.2.4 抗生素耐药诱变育种的应用前景
• 1.2.5 抗生素耐药性诱变存在的问题
• 1.3 放线菌的分类
• 1.3.1 多相分类方法
• 1.3.2 放线菌分类学研究的发展前景
• 1.4 论文的设计思路
• 1.4.1 选题的背景
• 1.4.2 选题的目的和意义
• 1.4.3 研究的技术路线
• 第二章 放线菌的分离、筛选及菌株B3 的抑菌活性
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 供试仪器
• 2.1.4 供试病原菌
• 2.2 方法
• 2.2.1 放线菌的分离、纯化及发酵培养
• 2.2.2 生物活性测定
• 2.2.3 菌株稳定性研究
• 2.2.4 菌株活性成分研究
• 2.2.4.1 发酵液中活性物质的 Doskochilova 溶剂系统鉴定
• 2.2.4.2 抑菌活性成分结构鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 分离结果
• 2.3.2 放线菌代谢产物生物活性测定
• 2.3.3 放线菌B3 发酵液抑菌活性筛选结果
• 2.3.4 菌株B3 传代稳定性
• 2.3.5 菌株B3 发酵液稳定性研究
• 2.3.6 菌株B3 活性成分研究
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 关于海洋放线菌的分离、筛选
• 2.4.2 抑菌活性成分的研究
• 2.4.3 链丝菌素
• 第三章 抗生素耐药性突变菌株的分离及筛选
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试药品
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 供试仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 耐药突变菌株的获得
• 3.2.2 耐药突变菌株的抗菌活性筛选
• 3.2.3 二次耐药突变菌株的获得
• 3.2.4 菌株产活性物质性能的传代稳定性研究
• 3.2.5 耐药突变菌株J22-G6 对白菜软腐病菌的抑菌活性
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 抗生素最小抑制浓度的测定及突变菌株分离
• 3.3.2 耐药突变菌株发酵液的杀菌活性
• 3.3.3 活性耐药突变菌株的二次诱变
• 3.3.4 二次耐药突变菌株发酵液的杀菌活性
• 3.3.5 耐药突变菌株发酵液杀菌活性的传代稳定性
• 3.3.6 耐药突变菌株J22-G6 发酵液对白菜软腐病菌的防治效果
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 菌株的分类鉴定
• 4.1 材料
• 4.1.1 供试菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 试剂及配制
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 形态特征观察
• 4.2.2 培养特征观察
• 4.2.3 生理生化特性
• 4.2.4 细胞壁的化学成分分析
• 4.2.5 分子鉴定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 形态特征
• 4.3.2 培养特征
• 4.3.3 生理生化特征
• 4.3.4 菌株细胞壁化学成分分析
• 4.3.5 菌株的分子鉴定
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 菌株J22-G6 发酵条件的优化
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 试验菌种
• 5.1.2 供试病原菌
• 5.1.3 培养基
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 菌种培养
• 5.2.2 种子培养
• 5.2.3 摇瓶发酵
• 5.2.4 抑菌活性测定
• 5.2.5 菌株发酵培养基和发酵条件优化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 不同碳源对菌株发酵产物抑菌活性影响
• 5.3.2 不同氮源对菌株发酵产物抑菌活性影响
• 5.3.3 不同金属离子对菌株发酵产物抑菌活性影响
• 5.3.4 Plackett-Burman 实验设计结果与分析
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 菌株J22-G6 发酵液中抑菌活性物质的分离、鉴定
• 6.1 材料
• 6.1.1 供试菌株
• 6.1.2 培养基
• 6.1.3 供试病原菌
• 6.1.4 仪器及试剂
• 6.2 方法
• 6.2.1 发酵液的制备
• 6.2.2 菌株发酵液的稳定性
• 6.2.3 发酵液中活性物质的 Doskochilova 溶剂系统鉴定
• 6.2.4 菌株发酵液中抑菌活性物质分离纯化
• 6.2.5 活性成分的结构鉴定
• 6.2.6 活性成分对细菌的抑菌活性测定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 菌株J22-G6 发酵液的热稳定性
• 6.3.2 菌株J22-G6 发酵液的酸碱稳定性
• 6.3.3 菌株J22-G6 活性物质的Doskochilova 溶剂系统鉴定
• 6.3.4 活性成分分离及结构鉴定
• 6.3.5 活性成分对细菌的抑菌活性测定
• 6.4 小结与讨论
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介
• 论文发表情况