论文摘要
有丝分裂过程中,通过染色体的分离,母细胞平均分配自己的遗传物质至子细胞,使子细胞得到完全相同的遗传物质。忠实的染色体分离和胞浆运动是保证两个子细胞得到完全相同的遗传物质的前提条件,上述过程的缺陷容易引起非整倍体或多倍体。Aurora是保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族之一,在染色体的分离和胞质运动中有非常重要的作用。Aurora家族的三个成员（Aurora A/B/C）在细胞有丝分裂的调控中起到重要的作用。根据众多研究成果显示,针对Aurora设计的小分子抑制剂能够有效的抑制肿瘤,是药物研发的一个热点。首先,我们成功的建立了有效的高通量筛选模型。采用这个高通量筛选模型,我们对国家新药筛选中心库藏的70,000个小分子化合物进行了高通量筛选,得到了近1000个一级阳性化合物,进而从一级阳性化合物中筛选出数十个二级阳性化合物。通过对所有实验组的检验,该模型的各项参数都达到了高通量筛选模型构建的标准。通过Biacore 3000检测,我们验证了阳性化合物与Aurora激酶的相互作用并计算结合动力曲线,证实阳性化合物与目标靶点有很强的结合能力。对化合物的激酶特异性进行检测,证实在参与测试的二十种激酶中,阳性化合物对Aurora激酶的抑制强度全部排在首位,对其他激酶大多没有非特异性抑制。为了进一步验证阳性化合物是否能够在细胞水平上对肿瘤细胞系的生长和增殖起到抑制作用,我们针对化合物的后期验证建立了专门的细胞模型。在国家重点实验室细胞库的支持下,我们对阳性化合物作用于近二十种细胞系的IC50进行了验证。实验证明,通过化合物培养基掺入处理96h,包括肝癌、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、宫颈癌、胰腺癌等多种组织来源在内的细胞系显示出不同程度的生长抑制。而在去除化合物后,部分细胞系恢复正常生长,另一部分细胞系无法恢复正常的快速生长状态。通过对多种细胞系的时间梯度和药物浓度梯度生长曲线进行检测,我们测定了化合物的细胞生长抑制IC50曲线。通过化合物掺入处理,肝癌、乳腺癌、结肠癌、皮肤癌、宫颈癌、胰腺癌等多种组织来源的细胞系增殖均受到了较大程度的抑制。克隆形成率试验证明,化合物处理的肿瘤细胞单克隆的形成能力大大下降。通过western blotting,immunofluorescence等方法,检测到内源性HistoneH3（Ser10）的磷酸化水平大幅下降,通过验证化合物在细胞水平对Aurora B激酶活性的抑制,初步探明了化合物抑制肿瘤细胞增殖的分子机理。流式细胞仪检测显示,化合物处理的细胞出现显著的G2/M期阻断。为验证化合物在体内对肿瘤生长的抑制作用,我们建立了化合物体内作用检测的动物模型。对于人QGY裸鼠移植瘤模型,化合物于5mg/kg的剂量即显示明显的抑瘤效果（p＜0.05）。通过小鼠急性毒理实验检测,化合物的半数致死量为有效剂量近40倍,在小鼠中未见明显副作用。长期以来,传统抗癌药物大都是属于细胞毒类药物。尽管传统抗癌药物具有一定的临床疗效,但由于它们无法区分肿瘤细胞和正常机体细胞,因而会引起严重毒副反应。2001年,诺华公司的酪氨酸激酶抑制剂药物格列卫（G1eveec）的上市,标志着激酶抑制剂类药物正式获得认可。2006年,多靶点药物多吉美（Sorafenib）的上市,更显示出了多靶点靶向性治疗药物的发展趋势。多吉美一方面通过抑制RAF/MEK/ERK信号传导通路直接抑制肿瘤生长,另一方面通过抑制VEGFR和PDGFR阻止为肿瘤提供营养的新生血管生成,通过双重作用机理而达到治疗效果。靶向性药物可以针对携带有特异性靶标的癌症细胞,同时具有较少的毒副反应,因此,靶向抗癌药物已经逐渐开始成为肿瘤治疗领域里的骨干力量。近几年来,针对Aurora的小分子激酶抑制剂药物开发得到了国际科研界和医药工业界的高度重视,出现了如ZM447439,Hesperadin,VX-680,AZD1152,PHA-680632等进入临床研究阶段的小分子抑制剂。因此,我们针对Aurora B的小分子抑制剂筛选及药学研究,以期为具有我国自主知识产权的小分子新药研发提供新的线索。另外,我们还就人类甘油磷酸化二酯酶（Glycerophosphodiesterphosphodiesterase,GDPD）基因的克隆和主要功能进行了初步研究。我们从人类睾丸cDNA文库中扩增GDPD5的全长序列。根据生物信息学分析,该基因在UCSC基因组数据库中定位在11q13.4-q13.5。通过免疫荧光实验,我们检测了GDPD5在亚细胞结构的定位情况,并以RT-PCR的方法分析GDPD5基因在人类各种组织中的表达。在此基础上,通过双荧光素酶报告系统对GDPD5可能影响的细胞信号转导通路进行检测,还将检测瞬时转染的GDPD5对细胞各项生理指标的影响。
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