江豚的增殖诱导配体（APRIL）基因和γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）基因的克隆、表达及生物学功能研究

论文摘要

第一部分,江豚增殖诱导配体（APRIL）的研究。APRIL是TNF家族的一个重要的免疫调控因子。在本研究中,我们首先通过RACE-PCR技术获得了江豚APRIL的全长cDNA序列（fAPRIL）,该基因编码一个含有247个氨基酸的多肽,该多肽含有一个预测的跨膜区域和一个TNF结构域。重组的可溶性fAPRIL融合蛋白（pET43.1a-fsAPRIL）以及Nus-His6标签蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到有效表达,并且得到有效纯化。进化系统分析表明,江豚和偶蹄目哺乳动物有比较近的亲缘关系。体外实验,可溶性fAPRIL（fsAPRIL）蛋白不仅能够和anti-IgM共刺激而促进淋巴细胞的存活/增殖,还能与淋巴细胞发生特异性的膜结合。第二部分江豚γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的研究。在本研究中,我们首先从江豚中获得了对天然免疫有重要作用的GILT的cDNA序列（FpGILT）。FpGILT基因编码一个含有244个氨基酸的蛋白,预测该蛋白的分子量为28kDa。FpGILT蛋白的氨基酸序列含有一个CXXC激活基序,一个GILT特征序列（CQHGX2ECX2NX4C）,三个N-连接的糖基化位点。进化分析表明,江豚GILT和其他物种的GILT是来源于一个共同的祖先,并且江豚和偶蹄目哺乳动物有比较近的亲缘关系。重组蛋白（FpsGILT）被有效的表达和纯化,并且体外巯基还原酶活性分析实验表明,FpGILT蛋白能够催化二硫键的断裂。对江豚APRIL基因和GILT基因的研究为对江豚及其它水生哺乳动物的适应性免疫和天然免疫的研究提供了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 绪论
• 第一章 增殖诱导配体（APRIL）的研究进展
• 1.1 TNF的简介
• 1.2 APRIL的发现及命名
• 1.3 APRIL的结构特点
• 1.3.1 APRIL的基因结构特点
• 1.3.2 APRIL的蛋白结构特点
• 1.3.3 APRIL的转录加工
• 1.3.4 APRIL的表达分布
• 1.3.5 APRIL的受体
• 1.3.6 APRIL的信号转导途径
• 1.4 APRIL的生物学功能
• 1.4.1 APRIL对B细胞的功能
• 1.4.2 APRIL对T细胞的功能
• 1.4.3 APRIL对体液免疫的作用
• 1.4.4 APRIL对肿瘤细胞的作用
• 1.5 展望
• 第二章 γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的研究进展
• 2.1 哺乳动物中干扰素的简介
• 2.2 GILT的发现及活性特征
• 2.3 GILT的分子特征
• 2.4 GILT的表达分布
• 2.5 GILT的研究概况,水平和发展趋势
• 第三章 关于江豚的介绍
• 第四章 江豚APRIL的克隆、表达、纯化以及生物活性鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物,质粒和宿主菌
• 4.1.2 试剂与耗材
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 血液样品总RNA的提取
• 4.2.2 江豚APRIL基因的克隆
• 4.2.3 生物信息学分析
• 4.2.4 原核表达载体的构建
• 4.2.5 重组pET-43.1a-FsAPRIL的表达、鉴定及纯化
• 4.2.6 重组蛋白的生物学活性检测
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 江豚全长APRIL（FAPRIL）cDNA序列及对应氨基酸序列
• 4.3.2 多重序列比对分析
• 4.3.3 蛋白质的三维结构模型
• 4.3.4 系统进化分析
• 4.3.5 pET-43.1a-fsAPRIL重组蛋白的表达与纯化分析
• 4.3.6 fsAPRIL蛋白对小鼠淋巴细胞的促存活作用
• 4.3.7 fsAPRIL蛋白对小鼠淋巴细胞的结合作用分析 26
• 4.4 讨论部分
• 第五章 江豚γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的克隆,表达和活性分析
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 血液样本总RNA的提取和逆转录
• 5.2.2 江豚GILT基因的克隆
• 5.2.3 生物信息学分析
• 5.2.4 原核表达载体的构建
• 5.2.5 重组蛋白的表达及纯化
• 5.2.6 体外巯基还原酶活性的检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 FpGILT cDNA序列的鉴定与特征
• 5.3.2 多重序列比对分析
• 5.3.3 进化树分析
• 5.4 pET28a-FpsGILT重组蛋白的表达纯化分析
• 5.5 巯基还原酶活性分析
• 5.6 讨论部分
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢