论文摘要
研究背景依据序列同源性和系统发育的不同，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors，FGFs）及其受体成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptors，FGFRs）家庭分别有22个FGF成员和5个FGFR成员。成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子受体结合所构成的FGFs/FGFRs信号传递是胚胎发育、血管新生、骨骼形成、肿瘤形成及伤口愈合、纤维化的重要原因之一。FGFRs是一个多基因家族，属免疫球蛋白基因超家族成员，均为酪氨酸激酶受体，在细胞的增殖、分化、血管生成、骨骼发育及生长和发育相关的进程中起着十分重要的作用。其中FGFR2的突变可引起一系列疾病，其外显子Ⅲa突变可引起Apert综合症（Apert Syndrome，AS），一种常见的人类多颅缝早闭所致的综合征，主要由两种Fgfr2功能增强型突变，即Fgfr2Ser252Trp（S252W）或者Pro253Arg（P253R）突变引起。Fgfr2S252W突变患者主要表现出严重的颅面部骨骼畸形，包括突眼和中面部严重发育不良，口腔临床表现为腭盖高拱，部分患者伴有腭裂，牙列拥挤和开牙合、错牙合畸形，迟萌，异位萌出，铲型切牙，额外牙，牙槽嵴膨隆，滞生牙，局部萌出等，给患者带来严重的生理缺陷及心理障碍，因此，寻求最佳模拟Apert综合征的模式动物进行研究刻不容缓。目前，多数研究集中于S252W突变引起的头颅和长骨及其信号通路的异常，然而，仅有少量报道研究下颌骨的改变。杜等利用EDMA定量比较了突变小鼠和对照小鼠下颌骨的形态和发育变化，发现随着年龄的增长，突变体下颌骨的缩短变得越来越严重。然而，下颌骨的发育是一个连续的、动态的过程，先前研究只是集中于突变体下颌骨解剖形态的改变，少有资料研究FGFR2S252W突变小鼠下颌骨微结构改变与年龄相关的动态变化。本课题利用基因敲入技术建立Fgfr2功能增强型突变小鼠进行研究。观察分析Fgfr2S252W突变小鼠骨骼表型的变化，探讨该小鼠作为Apert综合征小鼠模型的可行性。同时利用多种技术手段，从整体动物水平和组织蛋白等水平多层次、多角度地分析Fgfr2S252W功能改变对小鼠下颌骨微结构及牙齿结构的影响，初步探讨Apert综合征发病的遗传机制，为寻找相应临床治疗措施提供一定的实验依据。材料与方法第一部分Fgfr2S252W功能增强型突变对小鼠下颌骨影响研究1. Fgfr2S252W模式动物的繁殖、鉴定与分组：将雌性带neo基因+突变Fgfr2的基因工程小鼠和雄性EIIa-Cre小鼠交配，在子代中获得约1/4数量的Fgfr2S252W功能增强型突变小鼠。在纳入实验前，提取胎鼠或新生小鼠脚趾DNA作PCR基因型鉴定，提取肝脏总蛋白作Fgfr2蛋白表达测定，按照基因型分为野生型对照组（+/+）和突变型（S252W/+）两组进行相关实验研究。2.突变/对照小鼠体质量、鼻-肛门长度、下颌骨钙磷含量测定及阿尔辛蓝-茜素红骨架染色判断突变小鼠骨量变化。测定血清钙磷含量，了解体内钙磷代谢是否与骨骼矿化有关。3.为研究FGFR2S252W小鼠下颌骨骨量变化时骨骼微结构有无改变，实验利用H&E染色及Micro CT从二维及三维角度对P28和P56龄小鼠骨松质和骨皮质微结构进行了分析。4.通过钙黄绿素荧光双标检测下颌骨矿化沉积率，甲苯胺蓝染色检测成骨细胞数量，TRAP染色检测下颌骨破骨细胞数量。5.通过免疫荧光技术检测Erk1/2通路在Fgfr2S252W突变小鼠下颌骨生长障碍中的表达变化。第二部分Fgfr2S252W功能增强型增强对小鼠下颌牙齿影响研究1. Fgfr2S252W模式动物的繁殖、鉴定与分组：同第一部分。2.突变/对照小鼠下颌切牙的口外观察及离体对比观察，下颌切牙。下颌切牙和第一磨牙形态学Micro-CT测量。第一磨牙H&E染色观察成釉细胞、成牙本质细胞的变化。3.钙黄绿素荧光双标检测突变/对照小鼠牙齿矿化沉积率。4. E13.5（蕾状期）、E15.5（帽状期）、E18.5（钟状期）天胎鼠突变组和野生对照组乳鼠下颌切牙、第一磨牙形态观察。5.突变/对照小鼠下颌第一磨牙牙囊组织及牙乳头组织中p-ERK1/2表达差异比较。主要结果：一、Fgfr2S252W突变致小鼠下颌骨骨量减少，微结构改变1. Fgfr2S252W功能增强型突变小鼠具有类似人类Apert综合征的典型骨骼表型。包括冠状缝、PF缝早闭，圆颅和短颅畸形、中脸发育不良，下颌切牙伸长、反牙合等。2.从P7到第P56，每周测量突变小鼠和对照小鼠的体质量和鼻-肛门长度，均存在显著差异，且随着时间的延长，差异越来越明显，全骨架染色显示突变小鼠整体骨架缩小。P28和P56，钙磷含量在突变小鼠和对照小鼠血清中无差异，突变体体内钙磷代谢水平正常，提示Fgfr2S252W突变没有影响体内钙磷代谢。但钙磷含量在下颌骨中差异显著，提示FGFR2功能增强型点突变可能是直接影响了骨矿化，且与年龄无关。3.在P28和P56，突变小鼠矿化沉积率MAR均降低，甲苯胺蓝染色阳性的成骨细胞数量占骨表面的百分比（ob.s/BS）（%）均降低，TRAP染色阳性的破骨细胞数量在单位骨面积上含量均增多。提示FGFR2S252W突变可能导致了成骨细胞数量减少或功能降低，破骨细胞数量增多，且与年龄无关。4.下颌骨Micro CT定量的三维结构参数是对H&E二维染色结果的进一步验证，结果显示：在P28和P56，突变小鼠与对照小鼠比较，其骨松质的BV/TV、Tb.Th、Conn.D及DA均下降，Tb.N，Tb.Sp和SMI分别显著增加，骨皮质中BV/TV和C.Th降低，SMI升高，突变小鼠下颌骨结构的改变与年龄无关。5.采用免疫荧光技术研究磷酸化的Erk1/2在突变小鼠下颌骨骨组织中改变情况。结果显示，提高放大倍数后光学显微镜观察发现，突变小鼠下颌骨骨细胞中荧光信号增强，Erk1/2在突变小鼠骨组织中被激活。二、Fgfr2S252W突变致小鼠下颌切牙及第一磨牙异常1.突变组小鼠下颌切牙、第一磨牙冠长及冠根比较对照组增加。2.突变小鼠切牙矿化生长速率MRA明显高于对照小鼠。3.下颌切牙H&E染色显示Fgfr2S252W突变致成釉细胞、成牙本质细胞形态改变及数量增加，颈环缩小，上皮隔皱缩。第一磨牙H&E染色显示成釉细胞数量增加，成牙本质细胞无明显改变。4.对照小鼠下颌切牙成釉器E13.5（蕾状期）、E15.5（帽状期）、E18.5（钟状期）的发育均稍滞后于同时期突变小鼠牙胚的发育。同样现象出现在第一磨牙成釉器的各个发育时期。5. WB检测Fgfr2S252W功能增强型突变小鼠的牙囊组织、牙乳头组织中p-Erk1/2表达均增强。主要结论：1.通过基因敲入技术建立的Fgfr2S252W突变小鼠具有Apert综合征患者典型的颅面畸形，有望成为研究Apert综合征下颌骨及牙齿异常机制的良好模式动物模型。2. Fgfr2S252W功能增强型点突变导致小鼠下颌骨骨量下降及微结构的改变，且与年龄无关。3. Fgfr2S252W功能增强型点突变小鼠下颌骨骨量的下降可能由其成骨细胞及破骨细胞功能及数量改变共同引起。4. FGFR2功能增强后可能通过激活牙囊组织、牙乳头组织中Erk1/2信号通路导致突变小鼠下颌牙齿生长发育异常。综上所述：本课题的研究结果表明建立的Fgfr2S252W突变小鼠是研究Apert综合征的良好模式动物模型之一。本课题提示Fgfr2S252W功能增强型突变通过影响成骨细胞及破骨细胞功能和数量导致小鼠下颌骨骨量下降及微结构的改变，且与年龄无关。同时，Fgfr2S252W功能增强型突变可能通过激活牙囊组织、牙乳头组织中Erk1/2信号通路导致下颌牙齿生长发育异常。本研究为更加深入地理解Fgfr2S252W功能增强型突变在下颌骨、牙齿发育和疾病中的作用提供了实验依据，其具体作用机制有待进一步研究。
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标签：成纤维细胞生长因子型受体论文; 基因突变论文; 综合征论文;