红桂木凝集素对T淋巴细胞生长的影响

论文摘要

研究目的:红桂木凝集素的前期研究表明其可能是一种较理想的新的丝裂原。本课题将红桂木凝集素作用于T淋巴细胞,检测细胞生长的各项指标,探讨红桂木凝集素对T淋巴细胞生长的影响,为进一步从分子水平探明红桂木凝集素的作用机制及其在临床疾病防治等方面的开发应用奠定良好的理论和实验基础。方法:（1）参照本实验室常规分离、纯化红桂木凝集素的方法[1-2],将红桂木种子研磨,硫酸盐分级沉淀法盐析蛋白,采用Gal-Sepharose 6B亲和层析纯化蛋白,透析、超滤、冻干后,红细胞凝集实验检测红桂木凝集素活性,不连续PAGE电泳检测蛋白纯度,过滤除菌后,用BCA（bicinchoninicacid）试剂盒测定蛋白浓度,配制成红桂木凝集素不同浓度溶液,用于进行细胞实验。（2）分离正常人外周血T淋巴细胞,加入不同浓度的红桂木凝集素,以植物血凝素（PHA）做对照。作用不同时间后,a.应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的增殖率,倒置显微镜观察细胞形态及数目的变化;b.T淋巴细胞经血清饥饿同步化和不同浓度红桂木凝集素刺激后,采用碘化丙锭（PI）染色通过流式细胞术（flow cytometry assay;flow cytometry,FCM）分析其细胞周期,比较各时相细胞百分比的变化。c.应用荧光标记抗体结合荧光激活细胞分选法（fluorescence-activated cell sorting,FACS）检测T淋巴细胞CD4和CD8亚群的分布情况;d.应用荧光标记抗体结合FACS检测T淋巴细胞活化中期标志细胞分化抗原CD25分子表达的情况;（3）常规培养人急性淋巴细胞白血病Jurkat T淋巴细胞,将不同浓度红桂木凝集素溶液分别刺激JurkatT淋巴细胞,以植物血凝素（PHA）做对照,作用不同时间后,a.利用倒置显微镜和Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）法观察红桂木凝集素对Jurkat T细胞的集落形成和增殖的影响;b.应用荧光标记抗体结合FACS检测Jurkat T淋巴细胞活化中期表面标志细胞分化抗原CD25分子表达的变化情况;c.采用酶联免疫吸附实验方法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分别检测培养上清中 IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平;d.运用AnnexinV/PI双染FACS检测,分析红桂木凝集素对T淋巴细胞凋亡的影响;e.Jurkat T淋巴细胞经血清饥饿同步化和不同浓度红桂木凝集素刺激后,采用碘化丙锭（PI）染色通过FCM分析其细胞周期,比较各时相细胞百分比的变化;f.以Transwell小室迁移实验分析细胞迁移能力的变化;g.将不同浓度红桂木凝集素刺激后的细胞按不同时间收集,Western Blot检测MAPK信号转导通路蛋白p-ERK、p-p38和凋亡相关蛋白p-caspase-3的表达变化。结果:从红桂木种子中分离纯化得到红桂木凝集素,经红细胞凝集实验检测,凝集活力为29-211。不连续PAGE电泳检测结果显示为一条蛋白质主带,已达电泳纯。用磷酸盐缓冲液配制不同浓度红桂木凝集素溶液,蛋白定量检测浓度依次为,0.36、1.8、3.6、18、36、360μg/ml。MTT法结果显示红桂木凝集素对正常人外周血T淋巴细胞的生长有明显促进作用,红桂木凝集素浓度为360μg/ml时人T淋巴细胞的增殖率为127.63%（P<0.01）,且红桂木凝集素对T淋巴细胞的增殖作用具有剂量-效应关系,镜下可见T细胞数目明显增多,细胞的集落形成逐渐增多变大,细胞形态均匀增大轮廓清晰,透光度增加较圆亮。同步化处理的细胞经不同浓度红桂木凝集素作用24h后,G0/G1期比例逐渐降低,S期和G2/M期的比例逐渐增多,亦呈剂量相关性（P<0.05）,表明红桂木凝集素能促进细胞周期的进行,进一步证实红桂木凝集素能促进T淋巴细胞增殖;FACS分析证实红桂木凝集素主要促进CD3+CD4+亚群细胞的增殖,红桂木凝集素浓度为36μg/ml时可使CD3+CD4+亚群比例增加至80.59%（P<0.01）;红桂木凝集素可增强细胞表面中期活化标记分子CD25的表达,红桂木凝集素浓度为36μg/ml时,CD3+CD25+细胞比例达91.40%（P<0.01）,与空白对照组相比增加了 14.8倍,表明红桂木凝集素可明显促进T淋巴细胞的活化。Jurkat T淋巴细胞经不同浓度红桂木凝集素作用不同时间后,CCK-8法检测结果表明红桂木凝集素能够显著抑制Jurkat T淋巴细胞的生长,抑制率为1.82-59.17%（P<0.01）,且呈剂量-效应关系,其IC50为59.72μg/ml,镜下可见Jurkat T淋巴细胞的集落形成受到抑制,随着红桂木凝集素浓度增高,Jurkat T淋巴细胞数量明显减少,细胞的集落形成逐渐减少变小,且细胞大小不一,主要表现为细胞透光度降低,细胞整体轮廓不清;红桂木凝集素可增加细胞表面中期活化标记分子CD25的表达,红桂木凝集素浓度为1.8μg/ml时,JurkatT淋巴细胞中CD25+细胞比例达60.02%（P<0.01）,与空白对照组相比增加了9.3倍,表明红桂木凝集素可明显促进Jurkat T细胞的活化;红桂木凝集素对细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌均有明显促进作用,红桂木凝集素浓度为1.8μg/ml时,细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌与空白对照组比较分别增加了 11.69倍、21.29倍（P<0.01）;不同浓度红桂木凝集素作用于Jurkat T淋巴细胞不同时间后,FACS分析结果显示,红桂木凝集素能够诱导JurkatT淋巴细胞的凋亡,且细胞凋亡率与时间（P<0.05）和浓度（P<0.05）呈正相关,Western Blot表明Caspase-3活化明显增强;同步化处理的Jurkat细胞经不同浓度红桂木凝集素作用24h后,细胞周期停滞在S期,亦呈现剂量相关性（P<0.05）;不同浓度红桂木凝集素刺激Jurkat T淋巴细胞12h后,细胞的迁移率受到明显抑制,且呈现剂量相关性（P<0.05）;Western Blot检测显示,红桂木凝集素能显著上调p-ERKl/2和p-p38的表达,表明红桂木凝集素诱导Jurkat T淋巴细胞凋亡及细胞周期S期停滞可能与其激活ERK、p38信号转导通路有关。结论:（1）红桂木凝集素可促进正常人外周血T淋巴细胞的生长和细胞周期的进行,明显促进CD4亚群细胞的增殖和活化。（2）红桂木凝集素明显抑制Jurkat T淋巴细胞的生长,与其诱导Jurkat细胞周期S期停滞及细胞凋亡有关。（3）红桂木凝集素明显诱导Jurkat细胞活化,并促进细胞因子IL-2、IFN-γ的大量分泌,而Jurkat细胞过度活化是诱导其凋亡的重要因素。（4）红桂木凝集素明显抑制Jurkat细胞的迁移能力。（5）红桂木凝集素明显激活Jurkat T细胞内ERK和p38信号转导通路,增强caspase-3活化。

论文目录

• 英文缩略对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 红桂木凝集素的分离纯化
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 红桂木凝集素对人外周血T淋巴细胞生长的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 红桂木凝集素对Jurkat T淋巴细胞生长的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 课题综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的文章