自制组织芯片研究miRNA-155、HPV16/18在宫颈癌发生、发展过程的表达及临床病理意义

论文摘要

目的：子宫颈鳞癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，全球每年约有46.6万例的新发病例，其中80％发生在发展中国家，已成为发展中国家妇女最常见的恶性肿瘤和死亡的主要的原因，死亡率仅次于乳腺癌，是女性致死的第二大疾病[1]，且近年来发病率呈年轻化和不断上升趋势，严重威胁着女性的生命健康。子宫颈癌的发生和发展是涉及多种因素、多个步骤的病理过程，其发病机制至今尚未完全阐明。在过去的几十年里，针对子宫颈鳞癌的发生机制，国内外学者的研究方兴未艾，人们从蛋白水平到基因水平对其进行大量研究，对子宫颈鳞癌的临床诊断、鉴别诊断及指导临床治疗，都具有十分重要的意义。目前许多研究证实，人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是子宫颈癌发生的首要因素，尤其是高危型HPV16/18的持续感染与宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）及宫颈癌的发生与发展密切相关。HPV16/18的致癌过程常伴有原癌基因的突变或抑癌基因的失活，尽管高危的HPV感染是子宫颈癌发生的必要条件，但是单纯的HPV感染并不足以诱导宫颈癌的发生。因此，其他未知的基因很可能参与此过程。microRNA（miRNA）是由2125个核苷酸组成的一类内源性、非编码的小RNA，广泛存在于动植物中介导基因转录后的调节，参与调控机体各种生理进程，调节基因的表达活性[2]。在某些疾病中表达明显上调或下调，这一现象已经引起了各国学者的极大关注，其中miRNA-155是定位于人染色体21q21是BIC基因第三个外显子高度保守的RNA片段，是由2122个核苷酸编码的微小的、典型的多功能RNA。越来越多的研究表明在众多肿瘤中miRNA-155作为致癌基因或抑癌基因发挥着重要作用[3]，一些研究证实，miRNA-155在子宫颈癌发生过程中存在表达异常，但其表达是升高，还是降低则说法不一。目前由于技术水平的限制，miRNA-155在子宫颈癌中的致病机制究竟是什么，及其与子宫颈各级病变之间的关系还存在许多疑问。本课题通过自制组织芯片、原位杂交技术检测正常子宫颈鳞状上皮、各级别CIN病变、子宫颈鳞癌中miRNA-155的表达及HPV16/18感染情况，观察miRNA-155在不同病变中的表达，研究病毒感染在子宫颈癌变过程中的作用；探讨miRNA-155、HPV16/18与宫颈不同程度病变的关系及其相互之间可能存在的联系，分析HPV16/18感染对miRNA-155表达的影响，从而为临床寻找更为客观可靠的指标用以监测病变的进展，以及为进一步揭示HPV致癌机制及协同作用的因素提供依据，对子宫颈癌的早期预防、早期发现、早期治疗起到重要的指导作用。方法：1收集河北省人民医院子宫颈活检组织及手术样本共200例，其中正常子宫颈组织对照组31例，各级别CIN组织研究组共126例（其中CINⅠ级31例，CINⅡ级47例，CINⅢ级48例），子宫颈浸润性鳞癌组织研究组43例。2将200例供体芯片依照阵列设计的顺序，放入受体蜡块中，采取自制组织芯片技术经融合、切片、展片、捞片、烤片等工序制成所需要的组织芯片。3在正常宫颈鳞状上皮组织、各级别CIN病变及宫颈鳞癌中采用原位杂交技术检测miRNA-155的表达情况。4在子宫颈鳞癌、CIN病变组织及正常宫颈鳞状上皮组织中采用原位杂交技术检测HPV16/18的表达情况。5使用SPSS16.0统计软件进行数据处理，计数资料进行χ2检验、等级资料采用非参数秩和检验、相关性采用Spearman秩相关分析。以α＝0.05为检验水准，当P＜0.05时具有统计学意义。结果:1组织芯片的染色结果和制备情况根据试验方法及课题设计的要求制作3张组织芯片，使之符合8×8、8×9的阵列排序，点阵排列整齐，无移位现象，其中10个位点出现缺失现象，29个位点上缺乏有意义的组织，最后共得到有意义的样本162例（子宫颈鳞癌36例，CINⅢ级29例，CINⅡ级40例，CINⅠ级26例，正常宫颈鳞状上皮31例），组织位点的形态可观测率为81%。HE染色没有脱片现象、异位现象和皱褶现象，原位杂交染色阳性定位清楚、背景干净。2HPV-DNA16/18在不同病变的宫颈上皮中的表达运用原位杂交技术（ISH）检测HPV-DNA16/18，在36例宫颈鳞癌、95例CIN（包括29例CINⅢ级，40例CINⅡ级，26例CINⅠ级）及31例正常宫颈鳞状上皮组织中的表达。结果显示：正常宫颈鳞状上皮中HPV-DNA无表达，从CINⅠ到宫颈鳞癌，HPV-DNA的表达情况依次为50%（13/26）、67.5%（27/40）、79.3%（23/29）、52.8%（19/36），差异有统计学意义（P<0.05）。HPV16/18阳性率在CIN各级别病变中及子宫颈鳞癌中的表达明显高于正常宫颈鳞状上皮（P<0.05），CINⅢ级和宫颈鳞癌之间，差异具有统计学意义（P<0.05）。但CINⅠ级与CINⅡ级；CINⅡ级与CINⅢ级HPV-DNA表达差异无统计学意义（P>0.05）。3miRNA-155在不同病变的宫颈上皮中的表达采用原位杂交技术检测miRNA-155在36例宫颈鳞癌、95例CIN（包括29例CINⅢ级，40例CINⅡ级，26例CINⅠ级）及31例正常宫颈鳞状上皮组织中的表达。结果显示在正常宫颈鳞状上皮中miRNA-155主要在细胞浆强表达65％（20/31），miRNA-155阳性率在CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈鳞癌中的表达，明显低于正常宫颈鳞状上皮中的表达，表达情况分别为65％（17/26）、45％（18/40）、21％（6/29）、22％（8/36），存在显著性差异（p<0.05），且表达情况依次减弱。CINⅠ级及CINⅡ级、CINⅡ级和CINⅢ级、宫颈鳞癌和CINⅢ级之间miRNA-155阳性率均不存在差异（p＞0.05）。4子宫颈鳞状细胞癌中HPV16/18表达与miRNA-155表达的相关性分析子宫颈鳞状细胞癌中HPV16/18表达与miRNA-155的表达之间无明显相关性（p>0.05）。4子宫颈鳞状细胞癌组织中miRNA-155、HPV-DNA16/18的表达与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况及病理分级之间的关系HPV-DNA16/18表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移情况及病理分级之间均无明显相关性（p＞0.05）。HPV-DNA16/18表达与患者年龄、肿瘤大小、病理分级及淋巴结转移之间均无明显相关性（p>0.05）。结论:1原位杂交检测HPV16/18表达在鉴别高级别CIN与低级别CIN时有较高的特异度、阳性预测值及准确度，对CIN病变的发生发展具有很高的临床预测价值。2原位杂交检测miRNA-155在正常宫颈组织中高表达，在高级别CIN和宫颈鳞癌中没有明显表达；在鉴别高级别CIN病变与低级别CIN病变时没有较高的特异度、阳性预测值及准确度；对CIN的发展及临床预测价值不高。3宫颈鳞癌中HPV-DNA16/18表达与miRNA-155表达无相关性，提示两者在宫颈鳞癌的诊断过程中无协同作用。4miRNA-155、HPV-DNA16/18的表达与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移情况及病理分级之间均无相关性。5手工制做的组织芯片程序简单、经济方便，是一种简便可行，高效稳定的技术方法，能够满足相关课题研究和实际工作需要。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 miRNA-155 与肿瘤关系的研究
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历