论文摘要
骨骼肌组织是由终末分化状态的多核肌纤维组成,哺乳动物出生后肌纤维数量基本不变,而当其受到外界刺激(损伤、锻炼等)时,处于静息状态的骨骼肌卫星细胞就会被激活,从肌纤维肌膜与基底膜之间(解剖学位置)游离出来,经历增殖和定向分化,从而引起肌纤维肥大。因此认识肌肉肥大的机理,研究骨骼肌卫星细胞增殖分化过程对提高肉品质尤为重要。众多研究证明,Wnt/β-catenin信号通路在发育过程中发挥重要作用,对胚胎发育、细胞增殖、分化以及凋亡都有影响。而Wnt/β-catenin信号通路在骨骼肌生成中的作用已被论证,Wnt对非洲爪蟾、禽类及哺乳动物骨骼肌的形成是必须的,是决定卫星细胞命运及成肌细胞终末分化关键调控因子。有研究者证明,表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)不仅对众多细胞的增殖有抑制作用,而且在体内和体外,EGCG都能对Wnt/β-catenin信号通路起到抑制作用。猪作为重要的产肉动物和模式动物,在生产和科研上都具有重要价值.因此,本研究以猪为研究对象,体外分离、培养骨骼肌卫星细胞,研究Wnt/β-catenin抑制剂EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,分析细胞周期变化情况,检测β-catenin对骨骼肌卫星细胞增殖和分化标志基因表达的影响,初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化中的作用机制,以期为骨骼肌卫星细胞参与肌肉再生和肌纤维肥大提供理论依据。1、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG处理处于增殖期的猪骨骼肌卫星细胞,采用MTT、和Western印迹等方法检测了细胞增殖情况。结果显示,与对照组相比,EGCG以时间、浓度依赖方式抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖,且这此过程伴随着β-catenin蛋白表达下降。这些结果说明:EGCG抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖以及β-catenin蛋白的表达。2、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG处理处于分化期的猪骨骼肌卫星细胞,免疫荧光和Western blot等方法检测了细胞分化情况。同对照相比,倒置显微镜下观察到了EGCG促进肌卫星细胞分化;Western blot检测到MyoG和MyHC蛋白水平上升;免疫荧光染色也发现了有更多的MyoG和MyHC生成。此外,EGCG提高了肌卫星细胞分化的融合指数。分化上述结果说明了EGCG增强了肌卫星细胞分化的能力且形成了更多的肌管。3、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞周期以及增殖分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响流式细胞术检测细胞周期结果表明,与对照组相比,经EGCG处理后,猪骨骼肌卫星细胞的G1期细胞比例上升,而G2和S期细胞比例下降,这说明细胞被阻滞在G1期,细胞的增殖受到抑制。利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG分别处理处于增殖期和分化期的猪骨骼肌卫星细胞,免疫荧光检测细胞增殖和分化过程中β-catenin亚细胞定位,及Wnt/β-catenin下游靶基因Cyclin D1蛋白表达情况。与对照组相比,EGCG促进猪骨骼肌卫星细胞的分化,并降低增殖标志基因MyoD以及Cyclin D1的蛋白表达量。此外,不论在猪骨骼肌卫星细胞增殖还是分化过程中,EGCG降低β-catenin的表达量,核内的β-catenin明显减少。综合以上结果:EGCG通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,影响其下游靶基因Cyclin D1的表达,从而使细胞周期阻滞在了G1期,最终抑制了肌卫星细胞的增殖。EGCG能促进猪骨骼肌卫星细胞的分化。
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