EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖分化影响及其机制的初步研究

EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖分化影响及其机制的初步研究

论文摘要

骨骼肌组织是由终末分化状态的多核肌纤维组成,哺乳动物出生后肌纤维数量基本不变,而当其受到外界刺激(损伤、锻炼等)时,处于静息状态的骨骼肌卫星细胞就会被激活,从肌纤维肌膜与基底膜之间(解剖学位置)游离出来,经历增殖和定向分化,从而引起肌纤维肥大。因此认识肌肉肥大的机理,研究骨骼肌卫星细胞增殖分化过程对提高肉品质尤为重要。众多研究证明,Wnt/β-catenin信号通路在发育过程中发挥重要作用,对胚胎发育、细胞增殖、分化以及凋亡都有影响。而Wnt/β-catenin信号通路在骨骼肌生成中的作用已被论证,Wnt对非洲爪蟾、禽类及哺乳动物骨骼肌的形成是必须的,是决定卫星细胞命运及成肌细胞终末分化关键调控因子。有研究者证明,表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)不仅对众多细胞的增殖有抑制作用,而且在体内和体外,EGCG都能对Wnt/β-catenin信号通路起到抑制作用。猪作为重要的产肉动物和模式动物,在生产和科研上都具有重要价值.因此,本研究以猪为研究对象,体外分离、培养骨骼肌卫星细胞,研究Wnt/β-catenin抑制剂EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响,分析细胞周期变化情况,检测β-catenin对骨骼肌卫星细胞增殖和分化标志基因表达的影响,初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化中的作用机制,以期为骨骼肌卫星细胞参与肌肉再生和肌纤维肥大提供理论依据。1、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG处理处于增殖期的猪骨骼肌卫星细胞,采用MTT、和Western印迹等方法检测了细胞增殖情况。结果显示,与对照组相比,EGCG以时间、浓度依赖方式抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖,且这此过程伴随着β-catenin蛋白表达下降。这些结果说明:EGCG抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖以及β-catenin蛋白的表达。2、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG处理处于分化期的猪骨骼肌卫星细胞,免疫荧光和Western blot等方法检测了细胞分化情况。同对照相比,倒置显微镜下观察到了EGCG促进肌卫星细胞分化;Western blot检测到MyoG和MyHC蛋白水平上升;免疫荧光染色也发现了有更多的MyoG和MyHC生成。此外,EGCG提高了肌卫星细胞分化的融合指数。分化上述结果说明了EGCG增强了肌卫星细胞分化的能力且形成了更多的肌管。3、EGCG对猪骨骼肌卫星细胞周期以及增殖分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响流式细胞术检测细胞周期结果表明,与对照组相比,经EGCG处理后,猪骨骼肌卫星细胞的G1期细胞比例上升,而G2和S期细胞比例下降,这说明细胞被阻滞在G1期,细胞的增殖受到抑制。利用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂EGCG分别处理处于增殖期和分化期的猪骨骼肌卫星细胞,免疫荧光检测细胞增殖和分化过程中β-catenin亚细胞定位,及Wnt/β-catenin下游靶基因Cyclin D1蛋白表达情况。与对照组相比,EGCG促进猪骨骼肌卫星细胞的分化,并降低增殖标志基因MyoD以及Cyclin D1的蛋白表达量。此外,不论在猪骨骼肌卫星细胞增殖还是分化过程中,EGCG降低β-catenin的表达量,核内的β-catenin明显减少。综合以上结果:EGCG通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,影响其下游靶基因Cyclin D1的表达,从而使细胞周期阻滞在了G1期,最终抑制了肌卫星细胞的增殖。EGCG能促进猪骨骼肌卫星细胞的分化。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 骨骼肌发育研究进展
  • 1.1 前言
  • 1.2 肌肉形成和形态发生素梯度
  • 1.2.1 体节发生(Somitogenesis)
  • 1.2.2 体节中形态发生基因表达模式
  • 1.3 调控肌肉形成的遗传网络
  • 1.3.1 成肌调节因子
  • 1.3.2 成对同源框转录因子
  • 1.3.3 正弦眼相关同源框转录因子
  • 1.3.4 其他基因调节机制
  • 1.4 成年肌肉形成
  • 1.4.1 肌肉特异的成年干细胞是卫星细胞
  • 1.4.2 生态微环境调节干细胞命运
  • 1.4.3 卫星细胞和其他位于肌肉干细胞的治疗潜能
  • 1.5 结论和展望
  • 第二章 Wnt/β-catenin 信号通路和 EGCG 对其抑制作用的研究进展
  • 2.1 Wnt 蛋白和 Wnt/β-catenin 信号通路
  • 2.1.1 Wnt 蛋白
  • 2.1.2 Wnt/β-catenin 信号通路
  • 2.2 Wnt/β-catenin 信号通路与骨骼肌发育
  • 2.3 EGCG 抑制 Wnt/β-catenin 信号通路的研究进展
  • 第三章 EGCG 对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响32
  • 3.1 实验材料
  • 3.1.1 实验动物
  • 3.1.2 主要仪器与设备
  • 3.1.3 主要试剂及配方
  • 3.2 主要实验方法
  • 3.2.1 单根肌纤维法分离培养猪骨骼肌卫星细胞
  • 3.2.2 免疫荧光染色
  • 3.2.3 MTT 法检测细胞增殖情况
  • 3.2.4 Western Blot
  • 3.2.5 流式细胞术检测细胞周期
  • 3.2.6 统计分析
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 猪骨骼肌卫星细胞形态学观察及其鉴定
  • 3.3.2 EGCG 抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖
  • 3.3.3 EGCG 抑制猪骨骼肌卫星细胞浓度筛选
  • 3.4 讨论
  • 第四章 EGCG 对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 实验动物
  • 4.1.2 主要仪器与设备
  • 4.1.3 主要试剂及配方
  • 4.2 主要研究方法
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 EGCG 促进猪骨骼肌卫星细胞分化
  • 4.3.2 EGCG 对成肌分化过程中 MyoG 和 MyHC 表达的影响
  • 4.4 讨论
  • 第五章 EGCG 通过抑制 wnt/β-catenin 信号通路影响猪骨骼肌卫星细胞增殖分化
  • 5.1 实验材料
  • 5.1.1 实验动物
  • 5.1.2 主要仪器与设备
  • 5.1.3 主要试剂及配方
  • 5.2 主要研究方法
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 EGCG 在猪骨骼肌卫星细胞增殖分化过程中抑制 Wnt/β-catenin 信号通路
  • 5.3.2 EGCG 最猪骨骼肌卫星细胞增殖过程中细胞周期的影响
  • 5.3.3 EGCG 通过抑制 wnt/β-catenin 信号通路下游靶基因 Cyclin D1 抑制骨骼肌卫星细胞增殖
  • 5.4 讨论
  • 结论和创新点
  • 有待进一步完善及深入研究的问题
  • 参考文献
  • 附录 1
  • 1.1 主要设备和仪器
  • 附录 2
  • 致谢
  • 作者简介
  • 相关论文文献

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