重组蛋白A的分离纯化工艺研究

论文摘要

金黄色葡萄球菌蛋白A具有与免疫球蛋白特异性结合的能力,在抗体的检测和纯化、免疫细胞化学、病原体的快速诊断以及免疫吸附治疗等领域有着广泛的应用。利用基因工程技术生产重组蛋白A （rPA）是大量获得蛋白A产品的主要方法,目前国外已经成功实现了其工业化生产,而国内在这方面仍大量依赖进口。为了实现rPA的国产化,本论文在实验室前期原核表达与发酵研究工作的基础上,尝试建立一种适合于大规模制备能够满足医用要求的rPA分离纯化工艺。本论文的研究内容包括以下几个部分：（1）研究rPA的提取与初分离纯化技术。确定采用80℃加热处理10 min去除大部分热不稳定的杂蛋白,75%（v/v）乙醇沉淀实现蛋白溶液的快速脱盐更换。（2）研究rPA的层析精分离纯化技术。首先优化了DEAE弱阴离子交换层析介质的合成条件。对于DEAE弱阴离子交换层析,主要考察了起始缓冲液pH对层析分离的影响,发现起始缓冲液pH对rPA纯化效果影响较小。优化后的层析条件为：采用线性离子强度梯度洗脱的方式,洗脱梯度：10倍柱体积,0-18%B线性洗脱；流动相A为25 mM Tris-HCl, pH 8.0,流动相B为25 mM Tris-HCl, lMNaCl, pH 8.0。对于MEP疏水电荷诱导层析,考察了配基密度、平衡缓冲液pH和盐浓度、洗脱缓冲液pH等对rPA纯化的影响,发现高的配基密度有利于增大结合容量,而对选择性影响较小,平衡缓冲液pH和盐浓度对rPA的结合影响较小,rPA的结合具有非盐依赖性。优化后的层析条件为：平衡缓冲液为25 mM Tris-HCl, pH 8.0,洗脱缓冲液为100 mM柠檬酸缓冲液,pH 3.5。（3）在上述研究基础上,通过合理选择与组合,确定了rPA分离纯化工艺路线：细胞破碎后依次采用热沉淀、乙醇沉淀、离子交换层析及疏水电荷诱导层析。进行了实验室规模rPA的分离纯化,终产品经SDS-PAGE、SEC-HPLC及RP-HPLC分析,纯度达到98%以上,总回收率为61%。并对终产品进行了鉴定分析,MALDI-TOF-MS测得分子量为32743.585 Da,等电聚焦电泳法测得等电点为4.46, Western blot显示具有良好的反应原性,N端序列分析证实纯化的rPA具有完整的N端序列,且具有与进口rPA相当的人IgG结合能力。最后对rPA保存方法的初步研究表明,纯化后的rPA保存在25 mM PBS, 100mM NaCl, pH 7.4溶液中,于-80℃冻存具有较好的稳定性。通过本论文的研究,建立了rPA的分离纯化工艺,研究结果为大规模制备rPA奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 金黄色葡萄球菌蛋白A
• 1.1.1 蛋白A简介
• 1.1.2 蛋白A的结构与功能
• 1.1.3 蛋白A的应用
• 1.2 重组蛋白A
• 1.2.1 重组蛋白A概述
• 1.2.2 重组蛋白A的国内外产业化现状
• 1.2.3 重组蛋白A的分离纯化工艺国内外研究进展
• 1.3 基因工程重组蛋白下游纯化技术
• 1.3.1 蛋白质纯化的三步纯化策略
• 1.3.2 纯化过程的关键技术
• 1.3.3 纯化技术的选择与组合
• 1.3.4 蛋白质纯化后的保存
• 1.4 论文的研究基础、目标及主要内容
• 2 rPA的提取与初分离纯化技术研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与仪器
• 2.2.1 材料和试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 BCA法测定总蛋白含量
• 2.3.2 体积排阻高效液相色谱外标法测定rPA含量及纯度
• 2.3.3 反相高效液相色谱外标法测定rPA含量及纯度
• 2.3.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.5 细胞破碎
• 2.3.6 热沉淀
• 2.3.7 乙醇沉淀
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 BCA法测定总蛋白标准曲线
• 2.4.2 HPLC外标法测定rPA标准曲线
• 2.4.3 裂解缓冲液离子强度优化
• 2.4.4 热沉淀条件优化
• 2.4.5 乙醇沉淀条件优化
• 2.5 小结
• 3 rPA的层析精分离纯化技术研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 材料和试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 DEAE弱阴离子交换层析介质的合成
• 3.3.2 DEAE弱阴离子交换层析条件优化
• 3.3.3 MEP疏水电荷诱导层析介质的合成
• 3.3.4 MEP疏水电荷诱导层析条件优化
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 DEAE Sepharose CL-6B的合成优化
• 3.4.2 DEAE弱阴离子交换层析洗脱缓冲液的盐浓度优化
• 3.4.3 DEAE弱阴离子交换层析起始缓冲液的pH优化
• 3.4.4 DEAE Sepharose CL-6B凝胶的动态结合容量测定
• 3.4.5 MEP疏水电荷诱导层析介质配基密度的优化
• 3.4.6 MEP疏水电荷诱导层析平衡缓冲液pH和盐浓度优化
• 3.4.7 MEP疏水电荷诱导层析洗脱缓冲液的pH优化
• 3.4.8 MEP Sepharose CL-6B凝胶的动态结合容量测定
• 3.5 小结
• 4 rPA的分离纯化工艺及终产品的鉴定分析
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 材料和试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 纯化工艺具体操作条件
• 4.3.2 终产品纯度测定
• 4.3.3 终产品Western blot分析
• 4.3.4 终产品分子量测定
• 4.3.5 终产品等电点测定
• 4.3.6 终产品N端序列分析
• 4.3.7 终产品与人IgG结合能力评价
• 4.3.8 rPA保存方法初步研究
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 纯化工艺总结
• 4.4.2 终产品纯度测定
• 4.4.3 终产品Western blot分析
• 4.4.4 终产品分子量测定
• 4.4.5 终产品等电点测定
• 4.4.6 终产品N端序列分析
• 4.4.7 终产品与人IgG结合能力评价
• 4.4.8 rPA保存方法初步研究
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 实验室构建的rPA氨基酸序列
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢