基于甘蔗渣水解液的发酵性丝孢酵母发酵产油脂的研究

论文摘要

生物柴油是一种重要的液体可再生能源产品。目前,生产生物柴油的原料主要有动植物油脂等。尽管生物柴油已在美国、欧盟、日本等国得到应用,然而,成本过高限制了生物柴油的推广。另外,大量利用植物油脂来生产生物柴油会导致食用油供应紧张,食品价格上涨。因此寻找一种廉价且可持续大量供应的原料是生物柴油产业化及广泛应用的关键。微生物油脂是油脂微生物在一定条件下积累在体内的油脂,与植物油脂有类似的脂肪酸组成。利用微生物发酵法获得油脂,不但可以缓解动植物油脂资源紧缺的局面,而且可望为生物柴油提供廉价原料。目前,生产微生物油脂所采用的限氮培养基成本过高,限制了微生物油脂的实际工业应用。我们在本实验室已筛选到一株能利用木糖发酵产油脂的发酵性丝孢酵母（Trichosporon fermentans）基础上,探索了发酵性丝孢酵母利用甘蔗渣半纤维素水解液中发酵产油脂的可行性,系统研究了各相关因素对细胞生长和油脂积累的影响。在上述研究基础上,采用响应面法对发酵条件进行优化,提高了油脂产率。为进一步降低生产成本和提高油脂生产效率,研究了在培养基中添加少量糖蜜代替有机氮对发酵性丝孢酵母细胞生长和油脂积累的影响,同时,在摇瓶分批补料发酵基础上于1 L发酵罐中对发酵进行了初步放大。将甘蔗渣粉碎后（粒径≤0.5 mm）用1.5%（w/v）稀硫酸进行水解,水解条件为:固液比（w/v）1∶10、温度121℃、时间1.5 h。将固体残渣过滤后得到稀酸水解液,总糖浓度为40.8 g/L,主要成分为木糖（30.2 g/L）、葡萄糖（5.2 g/L）、半乳糖（1.5 g/L）和阿拉伯糖（3.9 g/L）;并含有抑制细胞生长的成分,如乙酸、糠醛等。采用石灰乳中和、浓缩、活性炭吸附等步骤进行预处理,预处理后总糖浓度为122.5 g/L,其中木糖（92.9 g/L）、葡萄糖（16.8 g/L）、半乳糖（2.4 g/L）、阿拉伯糖（11.4 g/L）,而除乙酸外,其他抑制剂基本上被除去。发酵性丝孢酵母T. fermentans能够在预处理后的甘蔗渣水解液中较好地生长,并大量积累油脂,发酵9天后的生物量和油脂含量分别为34.2 g/L和39.9%,油脂产率为13.7 g/L,高于利用糖蜜（12.8 g/L）和水稻秸秆水解液（11.5 g/L）发酵时的对应值。气相色谱分析表明油脂主要含有豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸和亚油酸,其成分与植物油脂十分相似,可作为生物柴油的生产原料。单因素实验表明,适宜的发酵时间、碳氮比（C/N）、接种量、温度和初始pH分别为9d、168、10%、25℃和7.5。在此基础上,采用四因素三水平Box-Behnken设计法研究发酵时间、碳氮比（C/N）、接种量和初始pH值对发酵性丝孢酵母发酵产油脂的影响。依据所得的实验数据建立相应的数学统计模型,并进行响应面分析,确定最佳发酵条件为:发酵时间9 d、碳氮比（C/N）165、接种量11%、初始pH值7.6。在优化条件下发酵9d的油脂产率为15.8 g/L,与理论值15.6 g/L非常接近,相对误差为1.41%,表明所建立的数学模型能够较好地模拟实际发酵情况,具有很高的显著性。为进一步提高油脂产率和降低油脂生产成本,研究了摇瓶分批补料培养对发酵产油脂的影响。经过两次补料发酵13天后,油脂产率达到20.7 g/L。同时考察了在培养基中添加少量糖蜜代替昂贵有机氮源对发酵性丝孢酵母细胞生长和油脂积累的影响,结果表明在糖蜜浓度为8.5 g/L的水解液中,该酵母能够获得较高的油脂产率（12.4 g/L）。在上述基础上,研究了1 L发酵罐中以添加8.5 g/L糖蜜代替有机氮源的水解液为培养基时的分批补料发酵情况。经过三次补料发酵180 h后,油脂产率为24.6 g/L,油脂的比生产率为0.14 g/ （L?h）,比摇瓶分批补料发酵的比生产率（0.066 g/（L?h））提高了112%。该研究对于实现生物质资源的高值化利用及降低微生物油脂的生产成本具有重要意义,有助于解决限制生物柴油大规模生产和广泛应用的油脂原料瓶颈问题。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物柴油的兴起与发展
• 1.1.1 生物柴油的主要特性
• 1.1.2 生物柴油的生产和使用现状
• 1.1.3 生物柴油的生产原料
• 1.2 微生物油脂的研究与应用
• 1.2.1 微生物发酵油脂的特点
• 1.2.2 产油微生物的种类
• 1.2.3 微生物产生油脂机理及代谢调控
• 1.2.4 微生物油脂在生物柴油中的应用
• 1.3 木质纤维素的研究与应用
• 1.3.1 木质纤维素的组成和特性
• 1.3.2 木质纤维素的应用
• 1.4 响应面法
• 1.4.1 响应面法概况
• 1.4.2 Box-Behnken设计
• 1.5 本研究的主要内容和意义
• 1.5.1 本研究的主要内容
• 1.5.2 本研究的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂及原料
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养方法
• 2.2.2 菌体生物量的测定
• 2.2.3 残糖测定
• 2.2.4 油脂提取
• 2.2.5 微生物油脂甲酯化
• 2.2.6 微生物油脂脂肪酸组成气相色谱分析
• 2.2.7 水解液制备方法
• 2.2.8 甘蔗渣水解液组成液相色谱分析
• 第三章 发酵性丝孢酵母利用甘蔗渣水解液发酵产油脂的研究
• 3.1 甘蔗渣稀酸水解与脱毒预处理研究
• 3.1.1 甘蔗渣的稀酸水解
• 3.1.2 甘蔗渣稀酸水解液的脱毒预处理
• 3.2 甘蔗渣水解液糖成分与抑制剂成分分析
• 3.3 发酵性丝孢酵母利用甘蔗渣水解液发酵产油脂的研究
• 3.4 本章小结
• 第四章 响应面法优化发酵性丝孢酵母发酵产油脂的研究
• 4.1 单因素实验
• 4.1.1 发酵时间对发酵性丝孢酵母产油脂的影响
• 4.1.2 碳氮比对发酵性丝孢酵母产油脂的影响
• 4.1.3 接种量对发酵性丝孢酵母产油脂的影响
• 4.1.4 温度对发酵性丝孢酵母产油脂的影响
• 4.1.5 初始 pH 对发酵性丝孢酵母产油脂的影响
• 4.2 响应面法优化发酵性丝孢酵母发酵产油脂条件
• 4.2.1 四因素三水平Box-Behnken设计因素水平表
• 4.2.2 四因素三水平Box-Behnken实验条件表
• 4.2.3 响应面法优化发酵性丝孢酵母发酵产油脂条件
• 4.2.4 油脂产率的响应曲面分析及最佳发酵条件确定
• 4.3 本章小结
• 第五章 发酵性丝孢酵母分批补料发酵及初步放大研究
• 5.1 发酵性丝孢酵母利用甘蔗渣水解液发酵产油脂的分批补料发酵研究
• 5.2 发酵性丝孢酵母利用甘蔗渣水解液发酵产油脂的初步放大研究
• 5.3 本章小结
• 结论与展望
• 参考文献
• 附录一 校正曲线
• 附录二 色谱图
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢