纳豆固体发酵和纳豆激酶的催化特性

论文摘要

纳豆是一种亚洲东方传统的发酵产品，纳豆中的纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶，可口服吸收，溶解血栓，明显缩短纤维蛋白的溶解时间；相比传统的尿激酶和链激酶等药物，有快速溶解血栓、半衰期长、副作用小等优点。因此纳豆激酶是一种具有开发潜力的食源性溶栓药物，引起医药及食品研究领域的广泛关注。在纳豆固体发酵中，接种量为8%时，纳豆激酶的活性达到了972IU/g样品，比传统4％接种量提高了约64％。固体发酵24h，纳豆激酶活性达到709IU/g，培养时间延长酶活反而下降。发酵结束后，纳豆表面覆盖厚厚的白色粘物，能拉出很长的细丝。当豆子被切成2瓣时菌株在纳豆表面的生长最旺盛。纳豆固体发酵最佳条件为：大豆破碎2瓣、接种量为8%、发酵时间24h，纳豆激酶活力最高为976IU/g。用纤维蛋白平板法，比较了液体发酵和固体发酵的酶活力，液体发酵中纳豆激酶的酶活为142IU/mL，固体的最佳酶活为976IU/g。在纳豆芽孢杆菌BN-3菌株液体发酵中，发酵液的残糖量在最初16h以内是快速下降，从32mg/mL降至9mg/mL，说明此时菌株消耗糖迅速生长，在16h以后糖的消耗变化不大，说明菌株生长稳定，开始大量表达蛋白。纳豆激酶的酶活和蛋白质浓度变化基本一致，都在40达到最高值，时间延长酶活和蛋白质含量都将下降，发酵时间在40h左右，蛋白浓度达到的最大值0.214mg/mL，最高酶活力为174.72IU/mL。本实验数据显示在纳豆激酶液体发酵中纳豆杆菌活菌浓度、蛋白质浓度和纳豆激酶酶活之间存在很好的相关性，可以通过测定活细胞浓度来监控发酵进程。取BN-3菌株的发酵液离心，进行硫酸铵分级盐析沉淀，（NH4）2SO4饱和度范围为35%～70%，此时沉淀的蛋白质含量较高为29.77mg。确定分级盐析饱和度之后透析、浓缩；经过DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析，用0.1mol/LNaCl进行阶段洗脱，具有纤溶酶活性的脱峰冷冻干燥后，调节蛋白浓度为2.0mg/mL后进行SephadexG-100层析，获得了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳两条带的纤溶酶，用纤维蛋白平板法测其酶活。结果：比活力为24325IU/mg，活性得率为47%，纯化倍数7.5。本实验利用脱脂牛乳为原料,分析纳豆激酶在固体介质和液体介质中的催化乳蛋白水解特征，研究底物浓度、酶与底物浓度比（E/S）和酶解时间对酶水解的影响。本研究旨在为纳豆激酶的活性测定和乳蛋白的酶解条件做初步探索。在固体平板上，纳豆激酶水解乳蛋白的最佳酶解条件为酶解温度37℃，底物浓度2%、酶与底物浓度比（E/S）最适范围在414之间、酶解时间16h，此条件下平板上的水解效果最佳。在液体条件下，纳豆激酶水解乳蛋白最佳酶解条件为底物浓度2%、酶与底物浓度比（E/S）为610、酶解时间2.5h，此条件下乳蛋白的水解度达40%70%。本研究对纳豆激酶的活性测定和乳蛋白的酶解条件进行初步探索。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1. 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.3 研究内容和方法
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基和溶液
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 纳豆固体发酵最佳条件
• 2.2.2 蛋白浓度的测定
• 2.2.3 残糖量的测定
• 2.2.4 纳豆激酶活性测定的方法
• 2.2.5 纳豆芽孢杆菌固体发酵与液体发酵的比较
• 2.2.6 纳豆芽孢杆菌液体发酵过程的研究
• 2.2.7 纳豆激酶的分离提纯
• 2.2.8 纳豆水解蛋白条件
• 3 结果与分析
• 3.1 纳豆固体发酵最佳条件的确定
• 3.1.1 纳豆固体发酵最佳接种量测定结果
• 3.1.2 纳豆固体发酵最佳发酵时间测定结果
• 3.1.3 纳豆固体发酵中豆子的破碎程度对纳豆杆菌生长的影响
• 3.2 考马斯亮蓝标准曲线
• 3.3 葡萄糖标准曲线
• 3.4 尿激酶酶活标准曲线
• 3.5 纳豆芽孢杆菌固体与液体发酵酶活力的比较
• 3.6 纳豆芽孢杆菌液体发酵液特征
• 3.7 纳豆激酶的分离提纯
• 3.7.1 硫酸铵分级盐析结果
• 3.7.2 DEAE-SepharoseFastFlow层析图谱
• 3.7.3 SephadexG-100凝胶层析
• 3.7.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
• 3.8 纳豆激酶水解乳蛋白条件研究
• 3.8.1 素琼脂固体平板上纳豆激酶的扩散
• 3.8.2 固体平板上纳豆激酶水解乳蛋白
• 3.8.3 液体中纳豆激酶水解乳蛋白
• 4 讨论
• 4.1 纳豆固体液体发酵的研究
• 4.2 纳豆激酶的分离纯化
• 4.3 纳豆水解乳蛋白条件
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及发表的学术论文