猪瘟病毒广西梧州株Npro基因的克隆及其真核表达载体的构建与表达

论文摘要

猪瘟是一种高度传染性疾病,给世界养猪业造成巨大的经济损失。CSFV基因组的第一个蛋白Npro,具有蛋白水解酶活性,在瘟病毒属中较为保守。Npro可以对参与IFN-a/β转录的干扰素调节因子3（IRF3）起抑制作用,从而阻碍IFN-a/β的诱导途径。为了筛选出一个表达Npro蛋白的最佳真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞MHC I表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC I之间的关系,本研究克隆了广西典型CSFV流行毒株——梧州株Npro基因,插入pIRESneo和pcDNA3.0表达载体中,构建了2个真核重组表达质粒。质粒PCR及双酶切鉴定目的片段正确,说明目的基因真核表达载体构建成功。同时发现pcDNA3.0-NproPCR及酶切鉴定所见的目的片段比pIRESneo-N（pro）的要明显,质粒DNA的OD260/280值也明显比pIRESneo-Npro的高。构建成功的2个真核表达载体用脂质体转染法进行体外细胞表达,转染30h后检测表达情况。RT-PCR检测见明显目的片段,用His抗体进行间接免疫荧光检测发现Npro得到表达,并定位于细胞浆。同时发现pIRESneo-Npro转染后表达的蛋白水平比pcDNA3.0-Npro高,说明真核表达载体pIRESneo比pcDNA3.0更适合在PK15细胞中表达Npro蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 目录
• 英缩写对照表
• 第一章 前言
• 1 CSFV的一般特征
• 2 病毒的基因组结构
• pro蛋白'>3 N^pro蛋白
• pro蛋白与CSFV持续性感染的关系'>4 N^pro蛋白与CSFV持续性感染的关系
• 5 本课题研究的目的和意义
• 第二章 实验部分
• 第一节 材料与方法
• 1 材料、仪器及试剂
• 1.1 主要实验材料
• 1.2 仪器
• 1.3 制备感受态细胞所用试剂的配制
• 1.4 培养基的配制
• 1.5 引物
• pro的构建'>1.6 真核表达质粒pIRESneo-N^pro的构建
• pro的构建'>1.7 真核表达质粒pcDNA3.0-N^pro的构建
• 1.8 细胞培养相关试剂的配制
• 1.9 间接免疫荧光试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 病毒RNA的抽提
• pro基因'>2.3 RT-PCR扩增N^pro基因
• 2.4 PCR产物的胶回收
• pro的构建'>2.5 重组质粒pMD18-T-N^pro的构建
• pro和真核表达载体的双酶切'>2.6 pMD18-T-N^pro和真核表达载体的双酶切
• 2.7 测序及同源性分析
• 2.8 真核表达质粒的构建
• 2.9 脂质体法转染重组质粒
• 2.10 PK15细胞表达效果的检测
• 第二节 实验结果
• pro基因的扩增'>1 CSFV广西梧州株细胞毒N^pro基因的扩增
• pro重组质粒的双酶切鉴定'>2 pMD18-T-N^pro重组质粒的双酶切鉴定
• 3 测序及同源性分析
• 4 真核表达质粒的构建
• 5 RT-PCR及IFA法检测重组质粒的表达效果
• 第三章 讨论
• 1 实验设计
• 2 结果分析
• 3 展望
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表文章