链格孢菌强产毒菌株的筛选和限制性内切酶介导整合（REMI）转化的产毒诱变

论文题目: 链格孢菌强产毒菌株的筛选和限制性内切酶介导整合（REMI）转化的产毒诱变

论文类型: 硕士论文

论文专业: 植物学

作者: 伏建国

导师: 强胜

关键词: 链格孢菌强产毒菌株,紫外诱变,原生质体,限制性内切酶介导整合,产毒减弱突变株,验证

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 分离自紫茎泽兰的链格孢菌产生的真菌毒素具有开发生物源除草剂的潜力。菌株产毒能力大小直接影响到发酵产物的毒素含量和杀草效果，强产毒能力菌株的筛选对于产业化十分必要。本文通过链格孢菌不同菌株间与产毒相关的生物学特性进行比较研究，目的是筛选强产毒菌株。进一步，进行链格孢菌原生质体制备试验，探索最适合的体系和条件，之后，进行限制性内切酶介导整合(REMI)原生质体转化试验，摸索REMI转化的方法和条件，目的是获得产毒减弱REMI突变株，为产毒相关基因的克隆提供研究材料。分离自不同地区的链格孢菌菌株的产毒量不同，在继代培养的过程中也会发生产毒突变。通过液体培养产毒实验，从现有的21个链格孢菌菌株中筛选出产毒最强的菌株NEW。并对这21个链格孢菌菌株的部分生物学特性进行了比较研究，通过SAS统计软件分析了各生物学特性间的相关性。发现链格孢菌的致病力、产毒量和产孢量呈显著正相关。利用这一相关性，可以通过筛选致病力增强突变株来筛选强产毒突变株。紫外诱变是微生物育种最常用的方法之一。通过紫外照射对链格孢菌的产毒特性进行了诱变，获得了紫外照射时间对链格孢菌分生孢子的致死曲线，但最后并没有筛选到产毒增强的突变体。还需进一步的筛选或找出提高菌株产毒量的替代途径。以筛选出的产毒量最大的菌株NEW为供试菌株，研究了菌龄、酶系统、酶解时间、酶解温度及稳渗剂对链格孢菌原生质体制备的影响，探索出了适合链格孢菌菌原生质体制备的体系和条件：菌丝块在PD液体培养基中培养20h后收集菌丝体，以0.7 mol／L NaCl为稳渗剂，1％Lysing Enzyme、1％Drislase和1％Snailase3种酶溶液混合使用，30℃酶解3h。利用该方法获得的原生质体数量和再生率都符合转化的要求。对REMI的转化体系进行了摸索，确定了限制性内切酶的用量，质粒的形式及用量，成功地获得了链格孢菌的REMI转化子。从获得的转化子中筛选出四个致病力减弱突变株NEW001、NEW021、NEW061和NEW073。通过HPLC检测发现四个突变株的产毒量都有所下降，其中突变株NEW001的产毒量不足野生型菌株NEW的五十分之一，是克隆产毒相关基因的很好突变材料。对四个产毒减弱突变株致病力、产毒量、产孢量、孢子形态、菌落生长速率等生物学特性与野生菌株NEW进行了比较分析，相关性分析再次验证了产毒量、产孢量与致病力之间的正相关关系，为致病机理的研究提供了思路。PCR扩增验证了质粒pSH75插入了病原菌基因组中，获得的四个突变体，尤其是NEW001可用于下一步的基因克隆工作。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

前言

第一章 文献综述

1 链格孢菌毒素的种类

2 链格孢菌毒素除草活性的研究

3 植物病原真菌致病基因的研究进展

3.1 植物病原真菌致病基因的类型

3.2 植物病原真菌致病基因克隆策略

3.3 限制性内切酶介导整合(REMI)在真菌致病基因克隆中的应用

第二章 链格孢菌菌株间生物学特性比较及强产毒菌株的筛选

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果分析

2.1 菌落生长速率的比较

2.2 液体培养菌丝体生长量的比较

2.3 菌株产孢量的比较

2.4 孢子萌发率比较

2.5 粗毒素致病力比较结果

2.6 菌苔致病力比较结果

2.7 生物学特性相关性分析

3 讨论

第三章 链格孢菌强产毒菌株的紫外诱变筛选

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果分析

2.1 紫外诱变时间对孢子萌发率的影响

2.2 紫外诱变时间的选择

2.3 致病力突变株的初筛

2.4 致病力突变株的复筛

2.5 致病力突变菌株的产毒力验证

3 讨论

第四章 链格孢菌原生质体的制备和再生

1 材料与方法

1.1 供试菌株

1.2 培养基

1.3 试剂

1.4 原生质体制备

1.5 原生质体的检测和再生

1.6 再生菌株主要生物学特性比较

2 结果

2.1 菌龄对原生质体制备的影响

2.2 酶系统对原生质体制备的影响

2.3 酶解时间对原生质体制备的影响

2.4 酶解温度对原生质体制备的影响

2.5 稳渗剂对原生质体制备的影响

2.6 原生质体的检测与再生

2.7 再生菌株的生物学特性比较

3 讨论

第五章 链格孢菌限制性内切酶介导整合(REMI)转化及筛选

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 结果

2.1 质粒的提取、酶切及 PCR检测

2.2 转化子的筛选

2.3 限制性内切酶用量对转化的影响

2.4 质粒对转化的影响

2.5 弱致病菌株的筛选

2.6 弱致病菌株产毒量测定

3 讨论

第六章 产毒减弱突变株的生物学特性分析和REMI插入突变的 PCR验证

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和溶液

1.2 方法

2 结果

2.1 突变株的生物学特性比较分析

2.2 产毒减弱突变株 REMI插入突变的PCR验证

3 讨论

全文讨论

1 链格孢菌强产毒菌株的筛选

2 链格孢菌原生质体的制备

3 REMI转化和产毒突变株的筛选和鉴定

4 产毒相关基因克隆的展望

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

发布时间: 2006-10-20

参考文献

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