早期胚胎细胞中HBs和HBx基因的表达与其启动子甲基化状态的关系

论文摘要

【背景与目的】乙型肝炎是世界各国尤其是我国当前面临的重大公共卫生问题,因此其传播途径,发病机制及诊疗手段的研究一直是各国政府和科学家关注的课题。已有研究证实,乙肝病毒（HBV）基因能够整合到人精子染色体中,由精子带入受精卵的HBV基因能够在早期胚胎细胞中复制与表达,但其分子机制尚不清楚。DNA甲基化是表观遗传学修饰的一个重要内容,在早期胚胎发育中起重要的调节作用。它也是细胞调控宿主基因表达和进入细胞内的病毒基因表达的重要方式。HBV感染可导致宿主细胞表观遗传修饰异常,诱发染色体不稳定,进而影响胚胎的正常发育,整合在宿主基因组中的HBV基因将增加原发性肝癌发生的风险。本课题的目的是通过研究HBV基因在精子、早期胚胎细胞中的甲基化状况,探讨它与HBV基因在早期胚胎细胞中表达的关系。【材料与方法】（1）材料:①重组质粒pBR322-HBV;②6-8周龄雌性金黄地鼠;③人精子由HBsAg阴性的志愿者提供;④甲基化试剂盒（Chemicom公司,S7820）;（2）方法:①重组质粒转染技术:用pBR322-HBV转染人精子。②用PCR,斑点杂交技术:证实转染的人精子中含有HBV DNA。③人精子、金黄地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精及受精后培养技术:获得早期胚胎细胞。④甲基化PCR（MSP）检测技术:检测HBs和HBx基因启动子在精子和早期胚胎细胞中的甲基化状况。⑤甲基化测序PCR及BLAST分析技术:精确检测HBs基因启动子的甲基化状态。⑥RT-PCR技术:检测胚胎细胞中HBs和HBx基因的表达。【结果】①斑点杂交结果显示,用pBR332-HBV转染的人精子经6次洗涤后,洗液中已不再有HBV DNA,排除了由于洗液污染给实验结果带来的假阳性的可能。②PCR结果表明,精子和早期胚胎细胞基因组中含有HBV DNA序列。③通过人精子、地鼠去透明带卵母细胞异种体外受精及受精后培养,获得了实验所需的单细胞胚和2-细胞胚样本。④甲基化特异性PCR（MSP）检测结果表明,在重组质粒pBR332-HBV中,HBs和HBx基因启动子区是非甲基化的;而在精子基因组中HBs和HBx基因启动子区已经甲基化了;在单细胞胚和2-细胞胚基因组中,HBs和HBx基因启动子区呈去甲基化状态。⑤甲基化测序PCR（BSP）及BLAST分析表明,在精子基因组样本中可扩增出HBs基因启动子区112 bp的阳性条带,条带区域的所有CpG位点呈甲基化状态。⑥RT-PCR结果表明,由精子带入受精卵的HBs和HBx基因能够在早期胚胎细胞中表达。【结论】①HBs和HBx基因启动子区在重组质粒中是非甲基化状态。②HBs和HBx基因启动子区在精子基因组中呈甲基化状态。③受精后,HBs和HBx启动子区在单细胞胚和2-细胞胚基因组中呈去甲基化状态。④在单细胞和2-细胞胚中,由精子带入的HBs和HBx基因可在mRNA水平表达。⑤由精子带入的HBs和HBx基因在早期胚胎细胞中表达与其启动子区的去甲基化有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语中英文对照表
• 前言
• 技术路线
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 样本收集和实验动物处理
• 2.2 质粒与探针的制备
• 2.3 实验程序
• 结果
• 1. 受精率，单细胞胚和 2-细胞胚的培养结果
• 2.人精子、单细胞胚和 2-细胞胚基因组中 HBV 基因的检测
• 3.精子和胚胎中 HBs 和 HBx 基因启动子区 CpG 岛甲基化结果
• 4.HBs 基因启动子区的甲基化测序 PCR（BSP）结果
• 5.单细胞胚和 2-细胞胚 RT-PCR 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 附录：主要混合液及培养基
• 致谢
• 个人简介
• 附图