论文摘要
研究背景肝脏疾病种类繁多,我国以乙肝病毒所致的急慢性肝炎、肝硬化和肝癌最为多见,占肝病的80%以上。同时,随着各类药物（包括中医中药）使用的普及,药物相关性肝病也逐年增多,占了所有肝病的2%～5%,占爆发性肝衰竭的15%～30%。肝脏作为机体代谢的重要器官,一旦受损,将影响全身各个器官的功能。其中,肝衰竭是严重肝损伤的极端表现,可表现为肝性脑病、肝肾综合征、凝血功能异常等。已有研究表明,肝脏疾病发生后,不但引起肝脏功能的损伤,还将引起全身代谢的紊乱。最常见的有芳香/支链氨基酸代谢紊乱、电解质失平衡等。目前临床上对电解质的检测技术已经相对完善,但对代谢产物的检测尚缺少一种全面检测的技术手段。组学概念的提出为研究者提供了一个整体研究疾病的新思路,基因组学、转录组学、蛋白组学等已经不为大家所陌生,作为系统生物学最下游的代谢组学,是一门新的科学,主要研究生物体对病理生理刺激或基因修饰所产生代谢物的质和量的动态变化规律。这种整体的研究模式可全面了解代谢物质在疾病发生、发展过程中的变化规律,对发病机制研究以及疾病的诊断、治疗和疗效评估具有重要意义。因此,我们采用该理论,结合现代生物质谱技术,对D-半乳糖胺诱导的药物性肝衰竭动物和乙肝所致的慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者进行代谢组学研究。方法1、建立气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）为基础的肝病血清代谢组学平台,并应用该技术对D-半乳糖胺诱导的急性肝衰竭动物模型血清进行代谢组学研究,监测药物性肝衰竭发生前后以及生物人工肝治疗前后代谢谱的变化规律,结合多元数据分析方法,评估代谢谱对肝衰竭动物模型疾病诊断和预后判断的有效性。2、应用GC/MS建立正常人代谢谱,并对乙肝病毒所致重型肝炎和肝癌患者血清进行代谢组学研究,对照正常人的代谢谱,应用多元数据分析方法诊断肝衰竭和肝癌,评估血清代谢组学对肝病的诊断效果。3、建立超高效液相色谱-质谱联用（UPLC/MS）为基础的代谢组学技术平台,对D-半乳糖胺诱导的肝衰竭动物模型进行代谢谱检测,结合多元数据分析,评估造模以及人工肝治疗对代谢谱的影响。4、建立液相色谱.质谱联用技术检测乙肝病引起的肝病尿液代谢组学的方法,并对慢性活动性乙肝、肝硬化、肝癌以及其他部位的炎症和肿瘤患者的尿液进行代谢谱研究。5、探索常用统计方法以及多元统计软件对代谢组学数据分析结果的影响,并验证其在疾病诊断中的应用效果。结果1、建立了GC/MS检测肝病血清代谢谱的方法,在肝衰竭动物血清中检测到25种内源性代谢物。应用主成分分析（PCA）、典型判别分析（CDA）对25种代谢物进行多元统计分析,发现肝衰竭动物随着病情进展,代谢谱有一定的变化规律,生物人工肝治疗可阻断病情进展,恢复动物的代谢特征。2、初步建立了GC/MS技术为基础的正常人血清代谢谱;对乙肝病毒所致重型肝炎患者血清代谢谱进行对照分析,并经NIST数据库鉴定,获得25个内源性代谢物。经t检验,肝衰竭患者血清中有15个代谢物与正常人存在显著性差异,苯丙氨酸、谷氨酸盐等氨基酸在患者组中显著升高,果糖、葡萄糖等糖类显著减少,部分脂类也发生显著变化;通过正常与肝癌患者的比较,发现11个显著改变的代谢物。将代谢组数据导入MATLAB、SIMCA-P软件进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）等分析,代谢组数据可将正常人与肝衰竭和（或）肝癌患者分别聚类区分;应用SPSS软件进行典型判别分析,以终末期肝病模型（MELD）作为疾病严重程度标准,代谢组数据可对重型肝炎的病情严重程度进行分类。3、建立了UPLC/MS为基础的肝病血清代谢组学研究平台,并应用于肝衰竭动物模型。结合多元数据分析,LC/MS所检测的代谢物与GC/MS截然不同,但分组聚类结果类似,不但能分析造模对代谢谱的影响,还可评估生物人工肝治疗肝衰竭的作用。4、建立了UPLC/MS检测肝病尿液代谢组学的方法,对正常人、慢乙肝、肝硬化、肝癌以及其他器官炎症和肿瘤的患者进行代谢组分析,正常人与疾病组的代谢谱有显著不同,应用PCA、CDA、PLS等判别分析方法,可分别对正常人与慢乙肝、肝硬化、肝癌患者进行诊断。但三组患者不能完全分别聚类,肝硬化组患者分散于慢乙肝和肝癌患者聚类区域中。5、对不同的统计软件和数据处理方法进行考察,MATLAB、SIMCA-P、SPSS等软件的多元软件可进行代谢组学数据的处理。结论GC/MS和LC/MS作为代谢组学研究的常用工具,对代谢谱的检测具有互补作用。通过对急性肝衰竭动物模型、重型肝炎、慢乙肝、肝硬化和肝癌的代谢组学研究,代谢组学数据具有很好的疾病诊断作用,也具有一定的疗效评估作用。同时,对急慢性肝病的代谢组学研究,获得了正常人、不同肝病的特征代谢谱,部分揭示了肝病发生发展的病理机制。代谢组学作为现代生命科学的一个新的分支,对研究肝脏疾病的发病机制和指导临床诊治有重要价值。
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