肉（鱼）源性寄生虫检测方法的研究

论文摘要

内容摘要:食品安全是事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题,但食品中寄生虫（卵）污染所引起的食源性疾病流行,一直未得到足够的重视。面对日益严重的肉类及水产品中寄生虫的食品安全问题,大力研究和发展新型、快速、灵敏、集成、高通量的检测技术,己成为一个重要方向。而现有的检测方法还仅仅局限于病原学检查和寄生虫免疫学诊断技术,只能在患者发病后才能做到,此时只能治疗而不能预防。因此,建立食品中主要寄生虫的快速检测方法是很有必要的。本论文应用普通PCR、变性高效液相色谱和实时荧光PCR分别对鱼源性寄生虫中最常见的华支睾吸虫进行检测,采用基因芯片技术对三种肉源性寄生虫（绦虫、弓形虫和旋毛虫）进行检测。其中在对鱼源性寄生虫的检测中,利用寄生虫核糖体非转录区的ITS2区域高度可变的性质,设计特异性普通PCR引物;使用primer express 3.0软件在可变区设计合成华支睾吸虫实时荧光PCR的特异性引物和探针,经过引物特异性实验证明,自行设计的普通PCR引物及实时PCR检测用引物和探针特异性强;建立的实时荧光PCR及变性高效液相色谱检测华支睾吸虫法的灵敏性都达到了1.37×10-5ng/μL。本文还利用基因芯片方法建立食品中绦虫、弓形虫和旋毛虫三种肉源性寄生虫的快速检测技术,选用弓形虫B1基因、旋毛虫SB2基因、绦虫12SrDNA上的可变区设计引物及探针,点样于玻片制成基因芯片;寄生虫DNA经过引物扩增后与芯片上的探针杂交,然后通过扫描图象对结果的特异性、灵敏性等进行判断,此外还进行了模拟污染实验。结果表明:设计的引物能够扩增三种寄生虫,而且探针的特异性很高。本体系的基因芯片杂交检测灵敏度约为1.5×10-5ng/μL。以食品中弓形虫和旋毛虫为例,每200mg模拟污染样品中可以检测出10个弓形虫速殖子;每200mg模拟污染样品中可检测出1条旋毛虫。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 常见肉（鱼）源性寄生虫及危害
• 1.1.1 常见肉（鱼）源性寄生虫的种类
• 1.1.2 常见肉（鱼）源性寄生虫的危害
• 1.2 肉（鱼）源性寄生虫检测技术研究进展
• 1.2.1 实时荧光PCR 技术
• 1.2.1.1 实时荧光 PCR 的原理
• 1.2.1.2 实时荧光 PCR 的分类
• 1.2.1.3 实时荧光PCR 技术在寄生虫检测中的应用
• 1.2.2 变性高效液相色谱技术
• 1.2.2.1 变性高效液相色谱的原理
• 1.2.2.2 变性高效液相色谱的三种操作模式
• 1.2.2.3 变性高效液相色谱技术的应用
• 1.2.3 基因芯片技术
• 1.2.3.1 基因芯片技术的原理
• 1.2.3.2 基因芯片技术的分类
• 1.2.3.3 基因芯片技术在寄生虫检测中的应用
• 第二章 肉（鱼）源性寄生虫 DNA 的提取
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 供试虫株
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.1.3 主要仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 改进的酚-氯仿法
• 2.1.2.2 供试虫株DNA 的提取
• 2.1.2.3 模拟污染样品DNA 的提取
• 2.1.2.4 基因组DNA 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.2.5 基因组DNA 的纯度测定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
• 2.2.2 DNA 纯度的分光光度计检测结果
• 2.3 小结
• 第三章 鱼源性寄生虫的检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 供试虫株
• 3.1.1.2 主要试剂
• 3.1.1.3 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 普通PCR 检测华支睾吸虫
• 3.1.2.2 PCR-DHPLC 检测华支睾吸虫
• 3.1.2.3 实时荧光PCR 检测华支睾吸虫
• 3.1.2.4 特异性实验
• 3.1.2.5 灵敏性实验
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 普通PCR 特异性实验结果
• 3.2.2 PCR-DHPLC 特异性实验结果
• 3.2.3 实时荧光PCR 特异性实验结果
• 3.2.4 普通PCR 灵敏性实验结果
• 3.2.5 PCR-DHPLC 灵敏性实验结果
• 3.2.6 实时荧光 PCR 灵敏性实验结果
• 3.2.7 三种方法检测华支睾吸虫的比较结果
• 3.3 小结
• 第四章 运用基因芯片技术检测三种肉源性寄生虫
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.1.1 供试虫株
• 4.1.1.2 主要试剂
• 4.1.1.3 主要仪器
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 样品DNA 的提取
• 4.1.2.2 引物及探针的设计与合成
• 4.1.2.3 基因芯片的制备
• 4.1.2.4 PCR 扩增及产物纯化
• 4.1.2.5 基因芯片的杂交
• 4.1.2.6 基因芯片检测灵敏度实验
• 4.1.2.7 基因芯片检测特异性实验
• 4.1.2.8 基因芯片检测重复性和稳定性实验
• 4.1.2.9 基因芯片模拟污染实验
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 引物及探针的设计
• 4.2.1.1 引物及探针的设计过程
• 4.2.1.2 各虫株引物和探针位点的选择
• 4.2.2 杂交结果判断标准
• 4.2.2.1 杂交结果判断标准的确定
• 4.2.2.2 非特异性信号的判定标准的确定
• 4.2.2.3 重复实验的判定标准的确定
• 4.2.3 基因芯片特异性实验结果
• 4.2.3.1 探针的BLAST 同源分析
• 4.2.3.2 PCR 扩增电泳结果
• 4.2.3.3 基因芯片杂交扫描检测结果
• 4.2.4 基因芯片灵敏度实验结果
• 4.2.5 基因芯片重复性与稳定性实验结果
• 4.2.6 基因芯片模拟污染实验结果
• 4.3 小结
• 第五章 结论
• 本论文主要创新点
• 参考文献
• 致谢