金免疫层析法检测盐酸克伦特罗的工艺研究

论文摘要

随着免疫分析技术的发展及近几年食品安全等问题不断升级,金免疫层析技术以其特有的竞争优势在临床、现场检测和家庭自检中发挥着越来越重要的作用,但国内相关研发水品与国外却存在着很大的差距。本文旨在通过盐酸克伦特罗试纸条的工艺路线研究建立起从抗原设计到试纸条调试的整个免疫层析研发技术平台。首先根据盐酸克伦特罗的分子特征进行抗原设计,目前市售产品的盐酸克伦特罗完全抗原均采用重氮法合成,而本文则通过戊二醛法将抗原和偶联蛋白通过“五碳桥”连接起来,降低了载体蛋白的空间位阻效应,使得戊二醛法合成的完全抗原（OVA-GA-CL,偶联比25.2:1）相对于重氮法合成的完全抗原（OVA-CL,偶联比28.8:1）更易于捕获抗体。同时,通过亲和层析法和饱和硫酸铵法纯化的抗体经间接ELISA法检测,其效价分别为1:16000和1:32000。虽然相对于抗血清而言,纯化抗体的效价有所下降,但SDS-PAGE分析结果显示抗体纯度有很大的提高。其次,采用改进的Frens法制备胶体金溶液,操作工艺条件为:旋转蒸发仪水浴加热,将预热至80℃的氯金酸加入到柠檬酸三钠溶液中,最终制备出颗粒均一、单分散的10nm的胶体金溶液并通过透射电镜和全波长扫描等手段加以鉴定。最后,通过对样品垫预处理液、金标垫预处理液、抗原和抗体包被缓冲液、金标稀释液及金标制备工艺等的优化和调试,最终确定盐酸克伦特罗快检试纸条的灵敏度为16ng/mL。并经时间稳定性和重复性试验结果表明,本研究制备的试纸条可在常温保存3个月且批间和批内的重复性高达95%,显示出良好的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 免疫分析技术概述
• 1.1.1 免疫标记技术的发展概况
• 1.1.2 免疫层析技术概述
• 1.1.3 胶体金免疫层析技术的发展及趋势
• 1.2 盐酸克伦特罗概述
• 1.3 本文的主要研究内容
• 第二章 盐酸克伦特罗完全抗原的制备
• 2.1 原理
• 2.2 试剂与仪器
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 重氮法合成完全抗原
• 2.3.2 戊二醛法合成完全抗原
• 2.3.3 偶联物的鉴定及偶联比的计算
• 2.4 试验结果与讨论
• 2.4.1 完全抗原的鉴定
• 2.4.2 偶联比的计算
• 2.4.3 配料比对偶联抗原的影响
• 2.4.4 两种偶联方法的比较
• 第三章 多克隆抗体的纯化
• 3.1 试剂和仪器
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 Protein A 亲和纯化多克隆抗体
• 3.2.2 饱和硫酸铵法纯化多克隆抗体
• 3.2.3 SDS 凝胶电泳
• 3.2.4 抗体效价的检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 亲和纯化洗脱液pH 值的优化
• 3.3.2 纯化抗体SDS 鉴定
• 3.3.3 纯化抗体效价的检测
• 第四章 纳米金溶液的烧制
• 4.1 试剂和仪器
• 4.1.1 试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 胶体金溶液的烧制
• 4.2.2 金标溶液质量的鉴定
• 4.2.3 胶体金溶液制备条件的优化
• 4.3 实验结果分析和讨论
• 4.3.1 还原剂加入量对胶体金制备的影响
• 4.3.2 加热方法对胶体金制备的影响
• 4.3.3 试剂添加顺序胶体金制备的影响
• 4.3.4 胶体金的电镜图
• 第五章 金免疫层析试纸条的组装及调试
• 5.1 试剂和仪器
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.1.3 各缓冲液的配伍
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 金标的制备及各缓冲液的优化
• 5.2.2 样品垫处理液的优化
• 5.2.3 蛋白包被
• 5.2.4 试纸条的组装
• 5.2.5 试纸条灵敏度的测试
• 5.2.6 稳定性试验
• 5.2.7 批内和批间的重复性
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 金标制备最佳pH 值的确定
• 5.3.2 金标制备最小蛋白结合量的确定
• 5.3.3 金标制备结果的鉴定
• 5.3.4 金标封闭剂的选择
• 5.3.5 金标洗涤液缓冲系统的选择
• 5.3.6 金标稀释液保护剂的选择
• 5.3.7 样品垫处理液表面活性剂的优化
• 5.3.8 样品垫处理液蔗糖浓度的优化
• 5.3.9 试纸条灵敏度的测试
• 5.3.10 试纸条稳定性
• 5.3.11 批内和批间重复性
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢