花生白藜芦醇合酶基因在烟草根部的表达

论文摘要

白藜芦醇（Resveratrol,简称Res）,其化学名为3,5,4’-三羟基-反-二苯乙烯（3,5,4’-trihy droxysitlbene）,又名芪三酚,是一种重要的植物抗毒素,存在于虎杖、葡萄、花生等植物中,在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性,是一种天然的抗氧化剂,可以降低血脂,抑制血小板凝结,抗癌,抗炎,抗辐射,抗衰老,防治心血管疾病等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少,利用生物技术生产白藜芦醇有望高效生产白藜芦醇。白藜芦醇合酶（Resveratrol synthase,简称RS）是白藜芦醇合成的关键酶,本研究利用烟草根特异表达启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因在烟草根部的表达来生产白藜芦醇。本研究得到如下结果：1、以有机溶剂浸提法提取闽花6号花生三叶期的根、茎、叶、下胚轴中的白藜芦醇,以RP-HPLC法检测其含量,发现各组织器官中的白藜芦醇含量不等,且下胚轴中不含有白藜芦醇,其含量呈现根>叶>茎>下胚轴的趋势。2、利用PCR的方法,根据本实验分离得到的1503bp的NtR12启动子序列设计引物,从烟草基因组中克隆出烟草根、茎特异表达启动子NtR12,测序后得到5个序列有差异的启动子序列,通过利用PLACE database （availabled at http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html; Higoetal.1999）分析了该启动子的序列,该序列具有TATA-box, CAAT-box, ROOTMOTIFTAPOXl等顺式作用元件,具有典型的根特异表达启动子的特征。3、构建了烟草根（或含茎）部特异表达载体pB1121-NtR12-GUSA、pBI121-NtR12-RS,将本研究构建的两个载体与pBI121-NtR2-RS、pBI121-NtR6-RS载体经农杆菌介导转化本生烟草和烟草优良品种翠碧一号获得了转基因植株。4、用发根农杆菌001和发根农杆菌002分别侵染本生烟草和烟草优良品种翠碧一号无菌苗,进行无菌培养,发现发根农杆菌001侵染CB-1烟草、发根农杆菌002侵染本生烟草有利于进行快速发根,指出发根农杆菌诱导发根因菌株和植物寄主不同而异。将经过Kan筛选得到的转基因芽,分别进行自然生根培养和利用发根农杆菌诱异发根,发现用发根农杆菌侵染烟草可显著促进根的生长。5、将经过发根农杆菌侵染诱导的毛状根进行液体培养,发现液体培养可使毛状根大量生产,其生长速率比固体培养基快。6、提取转基因烟草叶片的DNA,经PCR检测以及根、茎、叶的RNA的提取、RT-PCR检测,证明已获得阳性植株,其白藜芦醇的提取鉴定尚待分析；经过发根农杆菌诱导的转基因烟草根中的RNA提取、RT-PCR验证以及白藜芦醇的提取鉴定也在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 白藜芦醇
• 1.1 白藜芦醇简介
• 1.2 白藜芦醇的结构及特征
• 1.3 白藜芦醇的分布
• 1.4 白藜芦醇的合成
• 1.4.1 白藜芦醇的生物合成
• 1.4.2 白藜芦醇的化学合成
• 1.5 白藜芦醇的生理活性
• 1.5.1 抗氧化、抗自由基
• 1.5.2 防治心血管疾病
• 1.5.3 抗肿瘤、抗癌
• 1.5.4 保护肝脏
• 1.5.5 抗衰老、延寿
• 1.6 白藜芦醇的植物抗病性
• 1.7 白藜芦醇提取及含量测定
• 1.7.1 白藜芦醇的提取
• 1.7.2 白藜芦醇的含量测定
• 1.8 白藜芦醇合酶基因（RS基因）
• 1.8.1 克隆的部分植物白藜芦醇合酶序列
• 1.8.2 白藜芦醇合酶的转基因研究
• 2 启动子
• 2.1 启动子的含义和结构
• 2.2 植物启动子的分类
• 2.2.1 组成型启动子
• 2.2.2 诱导型启动子
• 2.2.3 组织特异型启动子
• 3 发根农杆菌
• 3.1 发根农杆菌简介
• 3.2 发根农杆菌的研究与应用
• 3.3 存在的问题
• 4 本研究的目的和意义
• 5 本研究的技术路线
• 第二章 花生各组织器官中白藜芦醇的提取和检测
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器与试剂
• 2.3 色谱条件
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 白藜芦醇标准品储备液的制备
• 2.4.2 白藜芦醇标准工作液的制备
• 2.4.3 原料预处理
• 2.4.4 标准曲线的绘制
• 2.4.5 精密度实验
• 2.4.6 稳定性实验
• 2.4.7 重现性实验
• 2.4.8 闽花6号花生三叶期各组织器官中白藜芦醇含量的测定
• 3 结果分析
• 3.0 RP-HPLC色谱分析
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.2 精密度实验
• 3.3 稳定性实验
• 3.4 重现性实验
• 3.5 闽花6号花生三叶期各组织器官中白藜芦醇含量的测定
• 4 讨论
• 第三章 烟草根茎特异启动子NtR12的克隆及序列分析
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料制备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 烟草DNA的提取（CTAB法）
• 2.2.2 PCR扩增
• 2.2.3 目的片段的回收
• 2.2.4 回收的目的片断与pMD18-T Vector的连接
• 2.2.5 目的片段的克隆与测序
• 3 结果与分析
• 3.1 烟草DNA提取结果
• 3.2 PCR扩增获得了目的片段
• 3.3 NtR12启动子序列的结构功能分析
• 4 讨论
• 第四章 根（或含茎）特异表达载体构建
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 pBI121-NtR12-GUSA载体构建
• 2.2.2 pBI121-NtR12-RS载体构建
• 3 结果与分析
• 3.1 成功构建了载体pBI121-NtR12-GUSA及pBI121-NtR12-RS
• 1-RS载体的质粒提取'>3.1.1 pBI121-NtR12-GUSA载体及pBI121A-B₁-RS载体的质粒提取
• 3.1.2 质粒的酶切反应
• 3.1.3 重组质粒的PCR检测
• 3.1.4 重组质粒pBl121-NtR12-RS的单、双酶切验证
• 3.1.5 pBI121-NtR12-RS表达载体测序结果分析
• 3.2 各植物表达载体构建流程图
• 3.3 载体测序及序列分析
• 4 讨论
• 第五章 花生白藜芦醇合酶基因遗传转化烟草
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 pBI121-GUSA载体质粒转化农杆菌
• 2.2.2 对本生烟草遗传转化的Kan筛选浓度的确定（农杆菌介导的叶盘法）
• 2.2.3 根（或含茎）特异表达载体质粒转化农杆菌
• 2.2.4 烟草遗传转化
• 2.2.5 转基因烟草的分子检测
• 3 结果分析
• 3.1 载体质粒转化农杆菌
• 3.2 优化了本生烟草Kan筛选浓度
• 3.3 烟草遗传转化获得了转基因材料
• 3.3.1 转不同重组质粒的本生烟草的长势情况
• 3.3.2 本生烟草转基因苗的生根培养
• 3.3.3 转不同重组质粒的CB-1烟草的长势情况
• 3.4 转基因植株的白藜芦醇表达分析
• 4 讨论
• 第六章 发根农杆菌实现转白藜芦醇合酶基因烟草大量发根
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 工程菌的制备
• 2.2.2 发根农杆菌介导转化烟草CB-1和本生烟草无菌苗
• 2.2.3 两种烟草无菌苗毛状根的液体培养
• 2.2.4 发根农杆菌介导转化本生烟草及CB-1烟草转基因苗
• 2.2.5 分子检测
• 3 结果与分析
• 3.1 发根农杆菌转化本生烟草及CB-1烟草的培养条件优化
• 3.2 两种烟草无菌苗毛状根的液体培养
• 3.3 发根农杆菌介导转化本生烟草及CB-1烟草转基因苗
• 3.4 发根农杆菌介导转化本生烟草和CB-1烟草转基因苗的目的基因表达
• 4 讨论
• 第七章 结论与展望
• 1 结论
• 2 展望
• 参考文献
• 致谢