PYY基因—饮食交互作用与肥胖易感性的关系

论文摘要

肥胖是指体内脂肪组织过度蓄积而使体重超过正常，早在1948年世界卫生组织就提出肥胖症是一种可影响人类健康的慢性疾病，并将它列入疾病分类名单。肥胖既是一个独立的疾病，又是2型糖尿病、冠心病、脑卒中、高血压、脂肪肝、胆结石、部分癌症、痛风及骨质疏松等各种慢性病的重要危险因素，同时，有些肥胖者行动受限，在工作和生活中往往会受到歧视，容易产生自卑感，导致自杀率高、结婚率低等一系列社会问题。近几十年来，随着社会经济的发展和人们生活方式的改变，超重和肥胖症在一些发达国家和地区的人群中已达到流行的程度。世界卫生组织（WHO）已将肥胖列为全球性的、威胁人类健康的10大公共卫生问题之一，迫切需要深入研究其发生机制和寻找切实可行的防治措施。人类肥胖对象中，除极少数是由于单个基因突变或缺陷所致外，多数是由于许多易感基因在基因-基因和基因-环境相互作用下而形成的一种复杂的表型。人体观察和动物实验均表明，在特定的膳食环境下（如高脂高能膳食），部分对象容易发生肥胖，称为饮食诱导肥胖（diet induced obesity，DIO），而另一部分对象可维持正常体重，称饮食诱导肥胖抵抗（diet induced obesity resistant，DIO-R），说明遗传因素和饮食条件共同影响个体的肥胖易感性。研究肥胖易感性差异及其机制，可为肥胖的防治提供依据。引起肥胖的根本原因在于机体能量摄入大于消耗，多余的能量转化为脂肪储存于体内。多数肥胖对象都不同程度存在贪食现象，因此，正确食欲调节下的适量摄食对维持机体能量平衡和适宜的体重起着非常关键的作用。现有的研究表明，食欲的生理调节机制极其复杂，由外周及中枢神经内分泌系统共同构成“食欲调节网络”（Appetite Regulation Network，ARN），由下丘脑整合外周和中枢信号后做出精确的反应，因此，下丘脑在影响摄食和能量平衡中起重要作用。酪酪肽（peptide tyrosine tyrosine，PYY）是由36个氨基酸组成的小分子多肽，由分布在肠道远端的内分泌L-细胞分泌，进餐后其释放增加且与摄入的能量呈比例，PYY释放入血后由体内广泛存在的二肽酶Ⅳ将N末端的两个氨基酸切除，形成其在血液循环中的主要分子形式PYY3-36。近年发现：外周注射PYY3-36可使实验动物和人类志愿者摄食减少。其机制可能是通过PYY3-36与下丘脑弓状核NPY神经元的Y2受体特异性结合，抑制NPY释放，从而降低食欲，减少摄食。此外，肥胖对象空腹和餐后血浆PYY3-36水平均显著低于体重正常对照，提示PYY3-36缺乏是肥胖的原因之一，补充外源性PYY3-36或刺激内源性PYY3-36的生成而抑制食欲，均有望成为预防和治疗肥胖的有效措施。为进一步了解PYY基因-膳食脂肪交互影响在肥胖发生中的作用，我们在建立DIO和DIO-R大鼠实验模型的基础上，分析了PYY基因表达和分泌与肥胖易感性的关系，并探讨了膳食干预对肥胖易感动物PYY基因表达和分泌的影响及其对摄食和体重的调节作用，现将主要结果概括如下：第一部分高脂饮食诱导大鼠肥胖易感性差异的研究目的以SD大鼠为实验对象，用高脂高能饲料喂养，建立肥胖和肥胖抵抗动物模型，为研究膳食和遗传因素在肥胖发生中的作用及其机制提供实验动物。方法参照文献资料设计高脂高能饲料配方，用基础饲料60g、猪油15g、鸡蛋黄粉10g、脱脂奶粉8g、干酪素5g、白沙糖2g配制成高脂高能饲料。基础饲料总能量3.29kcal／g（其中蛋白质占21.88％、脂肪占13.68％、碳水化合物占64.44％）；高脂饲料总能量4.62kcal／g（其中蛋白质占20.00％、脂肪占49.85％、碳水化合物占30.15％）。将72只清洁级SD大鼠（雌雄各半，体重150～160g）适应性喂养1周后按体重随机分为基础对照组（雌、雄各9只）和高脂喂养组（雌、雄各27只），分别喂以基础饲料和高脂饲料13周。于第0周末过夜禁食10h采尾血，分离血清-20℃保存，检测空腹血糖和血脂水平。实验期间动物均单笼喂养，动物房温度（22±5）℃，相对湿度（50±10）％，自由摄食饮水，每日记录给食量和撒食量，每周称体重，每4周量体长，观察大鼠的摄食和体重增长情况，于实验第13周末参照对照组平均体重和标准差，将高脂饲料喂养组大鼠再分为饮食诱导肥胖组（DIO：体重＞（?）+1.96s）和饮食诱导肥胖抵抗组（DIO-R：体重＜（?）+1.0s）。过夜禁食10h后断头处死所有雌性大鼠，收集全血，分离血清和血浆，置-80℃冰箱保存待测。取肝脏制备冰冻切片，肾周白色脂肪组织制备石蜡切片，观察脂肪细胞的大小及形态。同时分离心、肝、肾、脾、卵巢及肾周、腰周、卵巢周围等部位的脂肪组织并准确称重。结果随着喂养时间推移，高脂喂养组大鼠体重差异逐渐增大，自第2～3周开始，DIO大鼠与DIO-R和对照组大鼠之间已具有显著性差异（P＜0.05），而整个观察期间，DIO-R与对照组间体重未见显著性差异（P＞0.05）。实验第13周，DIO大鼠体重、体长、Lee’s指数、脂肪湿重、脂体比、肝体比均显著高于DIO-R和对照组大鼠（P＜0.05），而DIO-R与对照组间上述指标差异均无显著性意义（P＞0.05）。脂肪组织切片可见，与对照组相比，DIO组脂肪细胞形态变圆，体积增大，DIO-R组脂肪细胞形态变圆，但体积增大不明显。肝组织切片苏丹Ⅳ染色显示，与对照组相比，DIO和DIO-R大鼠肝组织中均有较大脂滴，且DIO组脂滴数量更多，体积更大，并有脂肪空泡形成。实验开始时各组大鼠空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平均无显著性差异，第13周时，DIO大鼠TC、TG、LDL-C和FBG均显著高于对照组（P＜0.05），而DIO-R大鼠与对照组相比，仅TC和LDL-C显著升高（P＜0.05）。结论用含能量4.62kcal／g的高脂饲料（主要成分为饱和脂肪酸）喂养SD大鼠13周，动物体重增长的差异显著增加，参照基础饲料喂养组平均体重和标准差按体重分为肥胖（DIO）与肥胖抵抗（DIO-R），结果表明除体重具有显著性差异外，DIO与DIO-R组大鼠相比，内脏脂肪蓄积、肝脂肪变、血脂代谢异常等均显著增加，说明我们所选动物和饲料配方合理，成功建立了饮食诱导肥胖和肥胖抵抗实验动物模型。第二部分PYY基因表达及血浆水平与饮食诱导大鼠肥胖易感性差异的关系及其机制目的比较DIO与DIO-R大鼠摄食及能量摄入水平的差异，分析回、结肠PYY基因表达水平及血浆内源性PYY分泌水平与摄食及肥胖易感性的关系，探讨影响肥胖易感性的可能机制。方法动物分组及喂养方法同第一部分。记录动物的摄食量和体重增长情况，于13周末将所有雌性大鼠断头处死，分离下丘脑，每组随机取6只，匀浆后取上清-80℃保存，用放免法测定NPY浓度；各组剩余下丘脑取出后，置液氮速冻，-80℃冰箱保存，以备RNA抽提，RT-PCR法分析NPY，Y1，Y2和Y5受体mRNA表达。取大鼠固定部位回肠和结肠各1.0cm左右置液氮速冻，-80℃保存，以备RNA抽提，RT-PCR法分析PYY mRNA。取肾周白色脂肪组织100mg左右，置液氮速冻，-80℃保存，RT-PCR检测UCP2、UCP3及PPARγ2 mRNA表达。分别于实验前和实验结束时取空腹血样，分离血浆，-80℃保存，用放免法测定NPY和PYY浓度。结果DIO大鼠能量摄入量、能量利用率均显著高于DIO-R组和对照组（P＜0.01），而DIO-R组与对照组间差异无显著性意义。血浆NPY水平各组间差异无显著性意义，下丘脑NPY浓度DIO组显著高于DIO-R和对照组（P＜0.01），DIO-R与对照组间差异无显著性意义。血浆PYY浓度DIO-R组显著高于DIO组和对照组（P＜0.01），而DIO组与对照组间差异无显著性意义。回、结肠PYYmRNA表达DIO-R组显著高于DIO组和对照组（P＜0.05），DIO组回肠PYY mRNA表达高于对照组（P＜0.05），结肠PYY mRNA表达低于对照组（P＜0.05）。DIO组下丘脑NPY及其受体Y1，Y2，Y5 mRNA表达水平均显著高于DIO-R组（P＜0.05），DIO-R和对照组相比，除Y2受体mRNA表达显著降低（P＜0.05）外，NPY，Y1，Y5mRNA表达差异无显著性意义。DIO与DIO-R和对照组大鼠相比，UCP2和UCP3 mRNA的表达水平显著下降（P＜0.01），PPARγ2 mRNA的表达水平显著升高（P＜0.01），DIO-R组与对照组相比，UCP2、UCP3、PPARγ2mRNA的表达水平均显著上升（P＜0.01）。结论高脂饲料喂养可刺激DIO-R大鼠回结肠PYY基因表达和分泌，使血浆PYY水平升高，抑制下丘脑NPY的释放，使其维持正常的能量摄入，而高脂饲养时DIO大鼠PYY分泌未能相应增加，下丘脑NPY释放增加，可能是导致其能量摄入过多和肥胖的重要原因之一。同时，DIO大鼠UCP2、UCP3 mRNA的表达水平显著下降，PPARγ2 mRNA表达水平显著增加，可能与其能量消耗减少，能量利用率高于DIO-R组和对照组有关。第三部分膳食干预对饮食诱导肥胖大鼠PYY表达和分泌的影响目的探讨膳食营养成分和能量密度改变对DIO大鼠PYY表达和分泌水平的影响及其与能量摄入水平的关系。方法DIO及DIO-R动物模型的制备方法同第一部分。于实验第15周未，将DIO大鼠再随机分为两组，一组改为基础饲料喂养（DIO-HF／LF），另一组继续喂以高脂饲料（DIO-HF），DIO-R组和对照组仍分别喂以高脂饲料和基础饲料，观察动物的摄食和体重增长情况，8周后处死全部动物，取血样和组织样本进行相关指标测定，具体方法同第二部分。结果至15周末，DIO组能量摄入和体重均显著高于DIO-R组和对照组，而DIO-R和对照组间差异无显著性意义。当DIO大鼠转为基础饲料喂养后，DIO-HF／LF组的能量摄入量显著低于DIO-HF组（P＜0.01），而与DIO-R和对照组差异无显著性意义，DIO-HF的能量摄入和体重仍显著高于DIO-R和对照组。8周内体重增重以DIO-HF／LF组最低，显著低于其它各组，DIO-HF／LF组内脏脂肪总重、脂体比均显著低于DIO-HF组（P＜0.01），肝体比显著低于DIO-HF和DIO-R组（P＜0.05），与对照组差异无显著性意义。DIO-HF／LF组回、结肠PYY mRNA表达和血浆PYY水平均显著高于DIO-HF组（P＜0.05），DIO-R组回、结肠PYY mRNA高于对照组和DIO-HF组（P＜0.05），血浆PYY水平显著高于DIO-HF组（P＜0.05）而与对照组差异无显著性意义。下丘脑NPY mRNA表达水平DIO-HF／LF组显著低于DIO-HF和对照组（P＜0.05），DIO-R组显著低于DIO-HF组（P＜0.05）和对照组（P＜0.05）。下丘脑NPY浓度DIO-HF／LF组显著低于DIO-HF组、DIO-R组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），DIO-HF组显著高于对照组和DIO-R大鼠（P＜0.05）。结论个体的遗传背景和膳食成分共同影响其肥胖的发生和发展。长期高脂高能量密度膳食条件下，肥胖易感者PYY基因表达下调，内源性PYY分泌减少，下丘脑NPY释放增加，机体自主摄食量较大，容易因摄入能量过多而发生肥胖，而肥胖抵抗者PYY基因表达和释放增加，下丘脑NPY释放减少，可通过自发性减少摄食量来调节能量摄入水平，避免能量过剩和肥胖发生。但肥胖易感个体在低脂低能量密度膳食条件下，能维持正常的PYY基因表达和释放，因此，基础饲料喂养时不容易出现能量过剩和肥胖，且食用高脂饲料发生肥胖后改用基础饲料，仍能增加PYY基因表达和释放，减少能量摄入水平，从而减少体内脂肪的蓄积。提示高脂高能量密度膳食条件下，存在PYY基因表达和分泌障碍的个体容易因能量摄入过多而发生肥胖。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 正文
• 前言
• 第一部分 高脂饮食诱导大鼠肥胖易感性差异的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 PYY基因表达及血浆水平与饮食诱导大鼠肥胖易感性差异的关系及其机制
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 膳食干预对饮食诱导肥胖大鼠PYY表达和分泌的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 综述 胃肠激素与体重调节和肥胖研究进展
• 一、与饥饿感有关的胃肠激素
• 二、与饱腹感有关的胃肠激素
• 三、信号的整合
• 参考文献
• 附录一 全文缩写词
• 附录二 博士期间工作小结
• 致谢