维甲酸诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白的变化研究

论文摘要

本论文以维甲酸（retinoic acid,RA）处理人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,鉴定RA对人神经母细胞瘤细胞的终末分化诱导效果。在此基础上,综合应用亚细胞蛋白质组学分析、免疫细胞化学、细胞分子生物学等技术,对在SK-N-SH细胞诱导分化过程中核基质蛋白的变化进行了较为系统的研究。分析鉴定和确证了与神经母细胞瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白,并研究特异核基质蛋白与人神经母细胞瘤细胞相关癌基因、抑癌基因在细胞内的共定位关系与变化,探索它们在神经母细胞瘤细胞诱导分化过程中的调控作用,以期能够在较为整体水平上进一步认识神经母细胞瘤细胞癌变与逆转机理问题,从而找出神经细胞增殖与分化相关的靶向性蛋白。实验结果显示,经1μmol/L RA处理之后,人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖受到抑制,细胞生长抑制率达57.93%,细胞发生了G0/G1期阻滞。光镜和电镜观察结果显示,经1μmol/L RA处理后的SK-N-SH细胞形态和超微结构发生恢复性变化,细胞呈极性状、伸出多个轴突树突状突起、细胞逐渐变小变圆并融合在一起形成类似神经节样结构,并出现核质比例减小,细胞体积减小,细胞表面微绒毛减少,细胞核形态趋于规则、核仁数目减少,细胞核内异染色质减少、常染色质增多,细胞内线粒体和粗面内质网增多、高尔基体结构更为典型等变化;免疫细胞化学检测结果显示,经RA诱导处理后,SK-N-SH细胞内癌基因c-myc、c-fos表达产物减少,抑癌基因p53、p27表达产物增多;同时,RA能够促进SK-N-SH细胞的神经元特异性标志物NSE、Synaptophysin、MAP2的表达。选择性抽提整装光镜和电镜观察显示,经RA处理的SK-N-SH细胞核基质纤维和中间纤维数量和层次更加丰富,分布更为均匀,单丝成份增多,与核纤层联系更为紧密,形成贯穿整个核质区域的较为规则的纤维网络。双向凝胶电泳与MALDI-TOF质谱分析共鉴定出41个在RA诱导分化前后表达差异的核基质蛋白,其中在分化的SK-N-SH细胞中表达上调的蛋白点为:Vimentin、MTMR2、SUMO-3等;表达下调的蛋白为TRPV2、Nucleophosmin、Prohibitin等;处理后消失的蛋白为ATP synthase beta chain、PSB3;处理后新出现的蛋白为LGI1、SYCE1。蛋白质印迹杂交与免疫荧光显微镜观察确证了Nucleophosmin（NPM）、Prohibitin（PHB）、Vimentin和hnRNP A2/B1在SK-N-SH细胞分化过程中的表达变化及其在核基质上的定位。激光共聚焦显微镜观察显示NPM、PHB和hnRNP A2/B1与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内均存在一定的共定位关系,并且它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后均发生了改变。激光共聚焦显微镜观察结果还显示NSE、SYP和MAP2与癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内也存在一定的共定位关系,它们的表达水平和细胞定位在诱导分化前后也发生了变化。研究结果表明,1μmol/L RA能有效抑制人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的增殖活动,改变SK-N-SH细胞形态与超微结构特征,下调癌基因c-myc、c-fos和上调抑癌基因p53、p27等的表达,从而对人神经母细胞瘤细胞的分化具有显著诱导效果。在SK-N-SH细胞分化过程中,其核基质-中间纤维系统构型产生了与正常细胞相似的恢复性变化,并且出现了多种差异表达的核基质蛋白,其中NPM、PHB、Vimentin和hnRNP A2/B1为不同诱导分化物诱导多种肿瘤细胞分化后出现的共同差异核基质蛋白。而功能性共同差异核基质蛋白NPM、PHB、hnRNP A2/B1和神经元特异表达标志物NSE、SYP、MAP2与c-Myc、c-Fos、P53、Rb等均存在共定位关系并在SK-N-SH细胞分化过程中出现分布和位移变化的现象。由此证实了RA能够干预SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因的活性,改变一些与基因表达调控和细胞信号转导相关的重要核基质蛋白的表达,进而阻滞细胞周期,促使人神经母细胞瘤细胞分化。这为我们在较为整体的水平上深入研究肿瘤细胞诱导分化的调控机制以及阐明细胞癌变与逆转机理提供了科学依据和探索研究的新方向,并为神经母细胞瘤的诊断和抗癌药物的研究提供了新的靶向性蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 肿瘤细胞诱导分化机理研究及其深入方向
• 1.1 肿瘤细胞诱导分化机理研究的重要意义
• 1.2 肿瘤细胞诱导分化的研究现状及进展
• 1.3 肿瘤细胞诱导分化机理研究所存在的问题
• 1.4 肿瘤细胞诱导分化机理研究的深入方向
• 2 核基质与核基质蛋白研究
• 2.1 核基质的结构与功能
• 2.2 核基质蛋白
• 2.3 核基质蛋白和细胞增殖分化的研究
• 3 细胞核基质异常与细胞癌变的关系
• 4 神经母细胞瘤细胞诱导分化研究及其存在问题
• 5 本论文具体研究工作及其科学意义
• 材料和方法
• 1 试剂与材料
• 2 主要仪器
• 3 细胞培养与诱导分化处理
• 3.1 人神经母细胞瘤细胞培养
• 3.2 诱导分化剂与诱导分化处理
• 4 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化过程中生长曲线的测定
• 5 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化前后细胞周期分布的测定
• 6 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色及光镜观察
• 7 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的扫描及透射电镜样品制备观察
• 7.1 扫描电镜样品制备观察
• 7.2 透射电镜样品制备观察
• 8 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因表达产物的免疫细胞化学检测
• 8.1 相关癌基因表达产物的免疫细胞化学检测
• 8.2 相关抑癌基因表达产物的免疫细胞化学检测
• 9 人神经母细胞瘤分化标志物的观察
• 9.1 NSE表达样品的制备与观察
• 9.2 Synaptophysin表达样品的制备与观察
• 9.3 MAP2表达样品的制备与观察
• 10 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞核基质-中间纤维系统的选择性抽提样品的制备与观察
• 10.1 核基质-中间纤维系统的选择性抽提
• 10.2 核基质-中间纤维系统的整装光镜样品制备与观察
• 10.3 核基质-中间纤维系统的整装扫描电镜样品制备与观察
• 10.4 核基质-中间纤维系统的整装透射电镜样品制备与观察
• 11 核基质蛋白的提取
• 12 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 13 凝胶染色及图像分析
• 13.1 凝胶染色
• 13.2 凝胶图像分析
• 14 诱导分化前后差异核基质蛋白的胶内酶解
• 15 质谱分析及数据库检索
• 16 Western Blotting检测
• 17 免疫荧光染色
• 18 激光共聚焦显微镜样品的制备与观察
• 实验结果
• 1 RA对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的诱导效果
• 1.1 RA诱导分化前后SK-N-SH细胞的生长曲线观察结果
• 1.2 RA诱导分化过程中SK-N-SH细胞周期的测定结果
• 1.3 RA诱导分化前后SK-N-SH细胞形态和超微结构的观察结果
• 1.4 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞相关癌基因、抑癌基因表达的影响
• 1.5 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化特异标志物表达的影响
• 2 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化过程中核基质-中间纤维系统构型的影响
• 2.1 核基质-中间纤维系统的光镜观察结果
• 2.2 核基质-中间纤维系统的扫描电镜观察结果
• 2.3 核基质-中间纤维系统的透射电镜观察结果
• 3 RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白表达的变化
• 3.1 双向电泳与凝胶图像分析结果
• 3.2 质谱鉴定与数据库查询结果
• 4 SK-N-SH细胞经RA诱导分化前后特异核基质蛋白表达变化的确证
• 4.1 差异表达核基质蛋白Western-blot结果
• 4.2 核基质蛋白免疫荧光染色观察结果
• 5 RA诱导SK-N-SH细胞分化过程中特异核基质蛋白与相关癌基因、抑癌基因的共定位观察
• 5.1 NPM与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 5.2 PHB与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 5.3 hnRNP A2/B1与癌基因c-myc、C-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 6 RA诱导SK-N-SH细胞分化过程中神经细胞特异表达标志物与相关癌基因、抑癌基因的的共定位观察
• 6.1 NSE与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 6.2 SYP与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 6.3 MAP2与癌基因c-myc、c-fos以及抑癌基因p53、Rb表达产物在细胞内的共定位观察结果
• 讨论
• 1 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的诱导分化效果
• 1.1 RA对SK-N-SH细胞增殖与细胞周期的影响
• 1.2 RA对SK-N-SH细胞形态与超微结构的影响
• 1.3 RA对SK-N-SH细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响
• 1.4 RA对SK-N-SH细胞分化标志物表达的影响
• 小结:
• 2 RA对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质构型变化的影响
• 3 差异表达核基质蛋白与RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的关系
• 3.1 人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞诱导分化前后差异表达的核基质蛋白
• 3.2 共同差异表达核基质蛋白的功能分析
• 3.3 其他差异表达核基质蛋白的功能分析
• 小结
• 3.4 共同差异核基质蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中与相关基因产物的关系
• 4 神经细胞特异表达蛋白在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中与相关基因产物的关系
• 4.1 NSE与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系
• 4.2 Synaptophysin与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系
• 4.3 MAP2与SK-N-SH细胞中相关癌基因及抑癌基因产物的关系
• 小结:
• 5 RA诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的调控机制
• 结论
• 论文创新点
• 图版及说明
• 参考文献
• 缩略语及中英文对照
• 在学期间发表论文
• 致谢