论文摘要
普鲁兰酶（E C.3.2.1.41）是一种能够专一性切开支链淀粉分支中的α-1,6-糖苷键,从而剪下整个侧支,形成支链淀粉的解支酶。它在淀粉加工工业中有着非常重要的用途,可以大规模的提高淀粉的利用率和生产效率。普鲁兰酶可以单独使用,亦可以与其它酶配合使用,当前较成熟地应用于高葡糖浆,高麦芽糖浆和干啤酒生产中。普鲁兰酶的水解性质决定了它具有提高淀粉质原料利用率、降低粮耗的作用,因此它在淀粉加工工业中有着重要的用途和良好的市场前景。地衣芽孢杆菌的全基因组序列已在2004年被公布,对基因组序列分析显示,其中有一段大小为2133 bp的片段可能编码普鲁兰酶基因,并被标注为amyX。多年来,地衣芽孢杆菌作为外源基因表达宿主被用于包括普鲁兰酶在内的多种外源蛋白的表达,但有关地衣芽孢杆菌自身产生的普鲁兰酶及其基因则国内外均未见实验研究报道。本论文以PCR方法从地衣芽孢杆菌染色体DNA中扩增出amyX基因蛋白编码区,插入大肠杆菌表达载体pET28aT7启动子下游。经普鲁兰酶活性检测、SDS-PAGE及大肠基因组DNA的PCR扩增分析表明,普鲁兰酶基因在BL21（DE3）中得到了正确的表达。在实验室发酵时,检测到的酶活大约为5.6 U/mL。重组工程菌连续转接5代后,经接种培养、诱导发酵及PCR反应鉴定表明具有良好的遗传稳定性。重组菌所产的普鲁兰酶分子量约为80kD左右;重组酶的最适作用温度范围为35℃～45℃,在pH 6.0条件下,30℃～50℃之间酶活性变化不大;最适作用pH范围为5.5～6.5,在温度为40℃时,有较广泛的pH稳定范围,pH为5.0～7.0范围内,该酶都具有较高的活性;该酶具有很好的热稳定性,40℃保温64 h仍有40%的残余酶活。该酶反应不需要金属离子的参与,但是很多离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+对该酶有不同程度的抑制作用;添加Mg2+和Ca2+对酶活性有不同程度的促进作用;而添加K+、Na+、Li+、Ni2+和Ba2+对该酶无明显的激活或抑制作用;5×10-3mol/L的SDS使酶完全失活,这可能是由于该普鲁兰酶分子中缺乏二硫桥结构的缘故。对重组菌的发酵条件进行了初步优化,采取了单因素试验分别考察了不同的氮源、诱导时机、培养温度、初始pH、装液量、接种量对产酶的影响。得到了产酶的最佳培养基:酵母膏1%,蛋白胨1%,NaCl 1%,K2HPO4 0.017%,MgSO4·7H2 O 0.012%,MnSO4·7H2O 0.012%;产酶的最佳培养条件:培养3h后诱导,培养温度为20℃,培养基的pH值为6.0,装液量为250 mL摇瓶加入培养基20 mL,接种量10%。通过优化后酶活提高到6.5 U/mL左右。以上结果表明,本研究构建的基因工程菌能够表达普鲁兰酶,实验室摇瓶发酵时,酶活约为5.6U/mL;其粗酶的酶学性质得到了初步研究;通过对发酵条件进行优化,最佳发酵条件的普鲁兰酶产量平均可达到（6.5±0.1）U/mL。因此,该株工程菌所产的普兰酶为普鲁兰酶酶制剂的工业化生产及应用奠定了一定的基础。