论文摘要
乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国居女性恶性肿瘤的第一位,严重威胁着人们的生命健康。近些年来,由于对乳腺癌的早期发现,以及综合治疗手段的不断提高,其死亡率呈逐年下降趋势。然而伴有远处转移或复发患者的预后仍然很差。转移肿瘤由于治疗效果差,仅少数对当前的治疗敏感,已经成为致患者死亡的主要原因。因此,探讨乳腺癌的发病机制,寻找新的抑制其浸润转移的治疗靶点,对于降低乳腺癌的死亡率,延长患者的寿命,具有十分重要的意义。2004年,Yu和Khanna发现并提出Ezrin是参与调节肿瘤转移的重要因子。Ezrin参与肿瘤转移过程中的诸多环节,其通过调节黏附分子和信号转导等途径,参与了细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用,从而在肿瘤的发生发展和浸润转移过程中发挥重要作用。目前已经明确Ezrin在骨肉瘤和横纹肌肉瘤的浸润、转移过程中起着关键作用,但其是否与乳腺癌等其它恶性肿瘤的发生发展及生物学行为有关尚无定论。为此本研究分析了Ezrin在乳腺癌组织中的表达及其意义,并借助反义RNA技术和化疗药物的作用从不同方面研究了抑制Ezrin表达对高侵袭性人乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响及可能的作用机制,同时本研究还初步探讨了RhoA作为上游调控信号对Ezrin表达的影响,以期明确Ezrin在乳腺癌的发生发展和浸润转移过程中的作用,为以Ezrin为靶点的乳腺癌靶向治疗提供理论依据。本研究论文共分为四个部分:1 Ezrin与乳腺浸润性导管癌发生发展及预后的关系研究目的:探讨Ezrin蛋白在乳腺浸润性导管癌及导管内增生性病变中的表达及其临床病理意义。方法采用免疫组织化学方法,检测临床病理及随访资料完整的88例乳腺浸润性导管癌及54例导管内增生性病变组织中Ezrin的表达情况,分析其与CD44v6、E-Cadherin表达的关系及其临床病理意义,采用Kaplan-Meier法及COX模型分析Ezrin表达与乳腺浸润性导管癌患者预后的关系。结果1.1 Ezrin在不同乳腺导管病变中的表达情况Ezrin在乳腺不典型导管增生和浸润性导管癌组织中的强阳性表达率明显高于乳腺普通型导管增生和正常导管上皮组织（P<0.05）,而在浸润性导管癌组织中的强阳性表达率亦明显高于不典型导管增生组织（P<0.05）。可见随着乳腺正常导管上皮从普通型导管增生向不典型导管增生、浸润性导管癌发展,Ezrin的强阳性表达率逐渐上升。1.2乳腺浸润性导管癌Ezrin表达与临床、病理特征的关系乳腺浸润性导管癌Ezrin表达与腋窝淋巴结转移密切相关,伴有腋窝淋巴结转移病例Ezrin强阳性表达率明显高于不伴有淋巴结转移者（P<0.05）。Ezrin表达与乳腺浸润性导管癌组织学分级和临床分期密切相关,Ezrin强阳性表达率随分化程度的降低和临床分期的增高而明显增高（P均<0.05）。1.3乳腺浸润性导管癌Ezrin表达的预后意义Ezrin强阳性表达组患者在随访期内各时点的生存率均明显低于阴性表达组（P<0.05）。COX模型多因素分析显示,Ezrin强阳性表达及淋巴结状况、TNM分期均与预后有相关性（P<0.05）,可以作为判断乳腺浸润性导管癌患者预后的独立指标。1.4乳腺浸润性导管癌E-Cadherin、CD44v6表达与Ezrin表达的关系经Spearman等级相关检验,Ezrin表达与E-Cadherin表达呈负相关性,与CD44v6表达呈正相关性（P均<0.05）。2反义RNA抑制Ezrin表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响目的:特异性阻断Ezrin的表达,观察其对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和侵袭能力的影响,以期明确Ezrin在乳腺癌细胞浸润转移过程中的作用。方法将anti-pCR3.1- ezrin质粒经脂质体介导,转染入高转移性人乳腺癌细胞MDA-MB-231。应用Western-blot和RT-PCR方法检测Ezrin在MDA-MB-231细胞中的表达;MTT法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231细胞体外增殖能力的影响; Boyden小室法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力的影响。结果2.1反义RNA对Ezrin蛋白表达的影响转染anti-pCR3.1-ezrin后,MDA-MB-231细胞中的Ezrin蛋白在24 h后明显降低（P<0.05）,转染anti-pCR3.1-ezrin组的Ezrin蛋白表达为转染pCR3.1空质粒组的24.24%,为对照组的22.22%。2.2反义RNA对Ezrin mRNA表达的影响转染anti-pCR3.1-ezrin后,MDA-MB-231细胞中的Ezrin mRNA在24 h后明显降低（P<0.05）;转染空质粒组的Ezrin mRNA无明显变化。2.3反义RNA对MDA-MB-231细胞增殖的影响MTT法比色实验结果显示,转染anti-pCR3.1-ezrin组、转染空质粒组和对照组的OD值分别为0.41±0.018、0.765±0.058和0.795±0.061。转染anti-pCR3.1-ezrin组细胞的增殖受到明显抑制,抑制率达47.92%（P<0.05）。2.4反义RNA对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响Boyden小室法检测结果显示,转染anti-pCR3.1-ezrin组细胞的侵袭能力为对照组的50.5%±3.2%（P<0.05）,转染空质粒组的细胞侵袭能力与对照组相比无明显变化。3 RhoA信号转导通路参与调节Ezrin表达的作用研究目的:探讨RhoA信号转导通路参与调节Ezrin表达的可能作用。方法给予表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）作用不同时间后,应用Western-blot方法检测MDA-MB-231细胞内RhoA、RhoA磷酸化形式及Ezrin蛋白的变化情况。给予RhoA激酶特异性抑制剂fasudil预处理后,应用Western-blot方法在RhoA磷酸化和Ezrin蛋白的表达高峰时间检测二者的表达情况。结果3.1 EGF对RhoA的磷酸化和蛋白表达的影响Western-blot结果显示,给予EGF刺激后,p-RhoA水平逐渐升高,于30 min时达高峰;RhoA蛋白的表达无明显变化。3.2 EGF对Ezrin蛋白表达的影响Western-blot结果显示,给予EGF刺激后,Ezrin蛋白水平逐渐升高,于24 h时达高峰。3.3 Fasudil对EGF诱导的RhoA磷酸化及Ezrin蛋白表达的影响Western-blot结果显示,用fasudil预处理MDA-MB-231细胞后,EGF诱导的RhoA磷酸化水平受到明显抑制,抑制率为72.73%,同时Ezrin蛋白的表达水平亦受到明显抑制,抑制率为51.28%。4小剂量表阿霉素对乳腺癌细胞Ezrin表达和迁移的抑制作用及相关机制研究目的:探讨小剂量法玛新（进口表阿霉素epirubicin,EPI）抑制乳腺癌细胞迁移的作用机制。方法观察小剂量表阿霉素对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 Ezrin表达和细胞迁移的影响,及Ezrin与E-Cadherin、CD44表达的关系。不同剂量的EPI作用于MDA-MB-231细胞4 h后,Western-blot、免疫细胞化学和RT-PCR方法检测Ezrin、E-Cadherin和CD44表达的变化。伤口愈合实验检测细胞迁移能力的变化。MTT法检测小剂量表阿霉素对细胞活力的影响。结果4.1 EPI对Ezrin、E-Cadherin、CD44蛋白表达的影响Western-blot结果显示,在不同浓度EPI作用下,Ezrin和CD44的蛋白表达呈逐渐降低趋势。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用组中,两种蛋白的表达均明显低于对照组（P<0.05）。E-Cadherin的蛋白表达在不同浓度EPI作用下,呈逐渐升高趋势。2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用组中,E-Cadherin的蛋白表达明显高于对照组（P<0.05）。免疫细胞化学检测得出了相同结果。4.2 EPI对Ezrin、E-Cadherin、CD44 mRNA表达的影响RT-PCR检测结果显示,各处理组MDA-MB-231细胞中Ezrin mRNA的表达与对照组相比显著降低,且呈剂量依赖性（P<0.05）;EPI同样以剂量依赖性方式抑制CD44 mRNA的表达,而以剂量依赖性方式促进E-Cadherin mRNA的表达。4.3 EPI对MDA-MB-231细胞迁移的影响伤口愈合实验显示,随着EPI浓度的增加,迁移的细胞数逐渐下降。1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml作用组分别下降为对照组的78.6%、50.0%、35.7%、14.3%。对照组的伤口几乎完全愈合。4.4小剂量EPI对MDA-MB-231细胞无明显毒性作用MTT实验结果显示,EPI不同浓度（1、2.5、5、10μg/ml）作用组的OD值分别为0.92±0.26、0.91±0.35、0.97±0.06、0.89±0.21,与对照组（0.97±0.40）相比无明显差异（P>0.05）。结论1 Ezrin在乳腺导管癌的癌变中发挥一定作用。2 Ezrin可以作为判断乳腺浸润性导管癌患者预后的独立指标,其强阳性表达提示预后差。3 Ezrin表达与E-Cadherin表达呈负相关性,与CD44v6表达呈正相关性,可能借此参与调节肿瘤细胞的浸润转移。4 Ezrin蛋白的表达与人乳腺癌细胞的体外侵袭有关,阻断Ezrin的表达,可以有效抑制乳腺癌细胞的增殖和转移。5 RhoA可能作为Ezrin的上游信号转导途径参与调控肿瘤细胞的浸润转移。6小剂量表阿霉素能够以剂量依赖性方式抑制乳腺癌细胞的迁移,这一作用不依赖其细胞毒性。7小剂量表阿霉素能够以剂量依赖性方式从基因和蛋白两个水平抑制乳腺癌细胞Ezrin和CD44的表达,提高E-Cadherin的表达。