丁酸梭菌清液发酵和处理工艺

论文摘要

丁酸梭菌是一种广泛存存于土壤、人体或者畜禽肠道的厌氧芽孢菌。作为一种益生菌,临床研究证实,在治疗肠道、消化道疾病方而,能够取得显著疗效；在畜牧养殖方面,作为抗生素替代品在防治疾病、提高饲料利用率、促进生长和营养吸收、降低污染等方面取得良好经济效益和环境效益。随着研究深入,丁酸梭菌必将会有更广阔的发展前景。丁酸梭菌能够克服实际生产和应用中诸多不利条件,具良好应用潜能。本实验目的就是获得高含量菌体同时提高芽孢形成率。以往培养方式中,往往菌数较低,或者培养基中含有大量不溶性成分,引起发酵液后处理困难等问题,本实验探讨采用优化的清液发酵方式,提高菌数,发酵液经过简单处理即可获得高纯度菌粉。本课题从以下四个方面进行了发酵培养基和发酵工艺条件的优化：通过单因素实验筛选碳氮源及其合适浓度范围,设计PB实验,确定影响发酵的显著性因子为初始p11值,酵母粉、氮源M浓度。在此基础上,设定步长,最陡爬坡实验逼近最大响应值中心点区域,最后响应面设计实验得到优化后培养基成分为：葡萄糖2.0%（w/v）,氮源M 1.3%,酵母浸粉1.8%,氮源N 1.5%,硫酸铵0.1%,碳酸氢钠0.124%,玉米浆粉0.33%,金属盐C 0.02%,金属盐B 0.02%,金属盐A 0.002%,pH为7.5。再做单因素实验,以耐热芽孢率为指标,对促进芽孢形成的金属盐含量进行优化,得出金属盐A、金属盐B、金属盐C合适浓度范围,再做组合实验,得到优化后金属盐组合：金属盐C 0.05%,金属盐B 0.05%,金属盐A 0.1%,可使得芽孢率达到72%以上进一步优化发酵工艺条件,补料流加碳源并补碱控制pH,优化后发酵工艺条件：接种量3%-5%,控温37℃,搅拌转速50 r/min,发酵过程补加20%碳酸钠控制pH值6.5,在发酵开始后12 h,16 h,20 h,24 h四个时间点等量流加,流加葡萄糖总量为2%,发酵结果,镜检芽孢得率95%以上,发酵液菌数可达到2.3×109cfu/ml,比自然pH发酵结果提高2.6倍,与不流加碳源结果相比提高了1.16倍。最后,对丁酸梭菌分别运用喷雾干燥和冷冻干燥两种方式进行处理,喷雾干燥添加具有吸附保护作用的淀粉,添加3%淀粉取得较好效果,但存活率不超过37.6%。冷冻干燥,发酵液经过离心、菌体洗涤、加保护剂悬浮、预冻、真空干燥、收集菌粉检验等处理过程。优化后冻干保护剂添加量为：采用15%脱脂乳粉或10%海藻糖,发酵液与重悬液比例1：2,平衡时间30 min,最终冻干存活率达到89.7%和85.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 微生态理论的产生与发展
• 1.2 微生态制剂理论依据
• 1.2.1 优势种群理论
• 1.2.2 生物拮抗理论
• 1.2.3 生物夺氧理论
• 1.2.4 三流循环理论
• 1.3 微生态制剂生理作用
• 1.3.1 对病原微生物的抑制、排除作用,维持正常微生态平衡
• 1.3.2 刺激机体免疫应答机制
• 1.3.3 促进营养物质的吸收
• 1.3.4 抗过敏、抗肿瘤和抗突变活性
• 1.3.5 微生态制剂其他生理作用
• 1.4 微生态制剂在农业、畜牧业中应用
• 1.5 微生态制剂的菌种
• 1.5.1 天然菌种
• 1.5.2 诱变培育而成的菌种
• 1.5.3 基因工程类菌种
• 1.6 丁酸梭菌
• 1.6.1 丁酸梭菌简介
• 1.6.2 丁酸梭菌的生理功能及应用
• 1.6.2.1 促进生长功能
• 1.6.2.2 抑制杂菌,促进有益菌的生长
• 1.6.2.3 激活免疫细胞,促进免疫功能,改善并恢复肠道免疫力
• 1.6.2.4 有益代谢产物的产生
• 1.6.2.5 丁酸梭菌应用现状和前景
• 1.7 立题背景
• 2. 实验材料和实验方法
• 2.1 实验菌株
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 培养基
• 2.4 实验方法
• 3. 丁酸梭菌培养基和工艺优化实验设计
• 3.1 丁酸梭菌发酵培养基优化实验
• 3.1.1 单因素实验筛选碳源、氮源
• 3.1.2 Plackett-Burman设计筛选影响丁酸梭菌生长的显著因素
• 3.1.3 爬坡实验确定响应面实验因素水平的中心点
• 3.1.4 响应面分析确定显著因素的最优水平
• 3.1.5 确定优化后培养基最适接种量
• 3.1.6 丁酸梭菌在优化后培养基中的生长曲线
• 3.2 促芽孢生成金属盐优化实验
• 3.2.1 三种金属离子浓度梯度实验
• 3.2.2 金属离子组合实验
• 3.3 上罐发酵和流加培养
• 3.3.1 自然pH发酵
• 3.3.2 控制pH发酵
• 3.3.3 间歇补料并控制pH发酵
• 3.4 丁酸梭菌干燥工艺
• 3.4.1 喷雾干燥
• 3.4.2 冷冻干燥
• 3.4.2.1 丁酸梭菌冻干保护剂的选择
• 3.4.2.2 冻干菌粉的制备与计数方法
• 4. 实验结果与分析
• 4.1 碳、氮源优化实验
• 4.1.1 单因素实验筛选碳源
• 4.1.2 单因素实验筛选氮源
• 4.1.3 Plackett-Burman实验筛选影响丁酸梭菌发酵有显著影响因素
• 4.1.4 最陡爬坡实验确定响应面实验因素水平的中心点
• 4.1.5 响应面分析确定显著影响因素的最优水平
• 4.1.6 在优化培养基中不同接种量对丁酸梭菌浓度的影响
• 4.1.7 丁酸梭菌在优化后培养基中的生长曲线
• 4.2 促芽孢生成金属盐优化实验
• 4.2.1 金属盐A浓度对丁酸梭菌活菌数和芽孢率影响
• 4.2.2 金属盐B浓度对丁酸梭菌活菌数和芽孢率影响
• 4.2.3 金属盐C浓度对丁酸梭菌活菌数和芽孢率影响
• 4.2.4 金属盐组合实验
• 4.3 上罐发酵和流加培养
• 4.3.1 控制pH发酵和自然pH发酵
• 4.3.2 间歇补料并控制pH发酵
• 4.4 丁酸梭菌干燥工艺
• 4.4.1 喷雾干燥
• 4.4.2 冷冻干燥
• 5. 总结与讨论
• 5.1 实验总结
• 5.2 讨论
• 参考文献
• 致谢