基于端粒-FISH的棉花核型分析及高分辨率细胞学图的初步构建

论文摘要

棉花是世界上最重要的纤维经济作物。目前,棉花的全基因组测序工作已进入日程,但许多与之相关的基础研究工作还有待加强。而了解棉种间的亲缘及演化关系,以及棉花高分辨率细胞学图的构建都是基因组研究中重要而基础的工作。本文首次对棉花的端粒序列进行了研究,并将其与荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）技术相结合应用于棉花的核型分析中,在此基础上研究了二倍体棉核型的变异及演化;建立了棉花的粗线期-FISH技术体系,首次在A组棉粗线期染色体上初步构建了高分辨率的细胞学图,为进一步的工作奠定了基础。主要结果如下:（1）根据拟南芥3号染色体上一个含有端粒序列的BAC克隆（F23H6）设计引物,PCR扩增到了拟南芥类型的端粒序列（TTTAGGG）n,并将其克隆到质粒pAT1上。在以四倍体棉中期染色体为靶DNA,pAT1质粒为探针的FISH研究中发现所有染色体末端都有强弱不同的杂交信号。进一步的Bal31酶切动力学实验证明了上述杂交信号确实位于染色体最末端,由此证明了棉花具有拟南芥类型的端粒序列。用末端限制性片段（TRF）法测量了棉属2个四倍体棉种以及7个二倍体棉种端粒序列的长度,结果表明栽培棉种（包括二倍体的草棉）的端粒序列长度较长,约为20 kb左右,其他野生二倍体棉种的端粒序列的平均长度稍短,介于6 kb-20 kb之间。（2）首次利用端粒-FISH对二倍体棉7个亚组的代表种进行了核型分析。核型分析的结果表明,B组异常棉的核型最原始;D组雷蒙德氏棉的核型与异常棉类似,是一种比较原始的核型;C组的纳尔逊棉和E组的索马里棉也是一种比较原始的核型。A组的草棉、F组的长萼棉和G组的比克氏棉具有较进化的核型,且彼此有各自的特点。与其他棉种不一样,草棉的一个随体位于较大的染色体短臂上;长萼棉染色体相对长度值的范围最大,并且没有在短臂的末端发现有随体的存在;比克氏棉的sm型染色体最多,达到了10条,反映了其染色体的不对称性最高,是一种比较进化的核型。根据上述核型分析结果,并结合前人的研究成果,我们认为B组棉是最原始的棉种,而后在棉属的进化过程中,以B组棉所在的非洲作为核心,向四周扩散,较早的衍生出C、D、E组棉,较晚的衍生出A组棉。在E组棉的基础上进一步衍生出F组棉,在C组棉的基础上进一步衍生出G组棉。最终形成了今天二倍体棉种的分布格局图。（3）成功的发展了棉花粗线期染色体的FISH技术,该技术获得的粗线期染色体完整、舒张。以端粒序列作为探针的FISH研究表明,在每条染色体的末端都能检测到杂交的信号。分别在A组的亚洲棉和草棉的粗线期染色体上对45S rDNA进行了定位,发现亚洲棉具有3个45S rDNA位点,分别位于第3、6、8号染色体上,其中2个位点的杂交信号较强,一个位点的杂交信号较弱。草棉的三个45S rDNA位点分别位于第5、7、9号染色体上,同样是2个位点的杂交信号较强,一个位点的杂交信号较弱。根据A组棉粗线期染色体核型分析的结果,45S rDNA在染色体上定位,以及粗线期染色体上的常染色质区及异染色质区的分布特点,我们在此基础上初步建立了A组棉的高分辨率细胞学图。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物荧光原位杂交的原理和应用
• 1.1.1 荧光原位杂交的原理
• 1.1.2 植物荧光原位杂交技术的发展
• 1.1.3 植物荧光原位杂交技术的应用
• 1.2 植物重复序列的研究进展
• 1.2.1 植物重复序列的种类
• 1.2.2 r-DNA 重复序列
• 1.2.3 端粒重复序列
• 1.2.4 着丝粒重复序列
• 1.3 二倍体棉种起源与演化的研究
• 1.4 植物基因组研究中三大图谱的构建及整合
• 1.4.1 细胞学图
• 1.4.2 遗传连锁图
• 1.4.3 细胞学图与遗传连锁图整合成细胞遗传图
• 1.4.4 物理图
• 1.5 本研究的目的意义
• 第二章 棉属端粒序列的克隆和鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶和生化试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥类型端粒（TTTAGGG）n 序列的克隆
• 2.2.2 端粒（TTTAGGG）n 序列在棉花中的FISH 鉴定
• 2.2.3 棉花端粒序列的 Bal31 酶切动力学实验鉴定
• 2.2.4 TRF 法测量各棉种端粒序列的平均长度
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 拟南芥类型端粒序列的克隆
• 2.3.2 拟南芥型端粒序列在棉花中的FISH 鉴定
• 2.3.3 Bal31 酶切动力学实验对杂交信号的鉴定
• 2.3.4 末端限制性片段法（TRF）测量棉属端粒序列的长度
• 2.4 讨论
• 2.4.1 端粒-FISH 中端粒探针的制备
• 2.4.2 植物端粒序列的类型
• 2.4.3 测量端粒序列的长度在基因组测序中的意义
• 第三章 棉属二倍体棉基于端粒-FISH 的核型分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 酶与生化试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 棉花的端粒FISH
• 3.2.2 二倍体棉中期染色体的核型分析
• 3.2.3 二倍体棉核型模式图的构建
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 草棉（A 组）端粒FISH 核型
• 3.3.2 异常棉（B 组）端粒FISH 核型
• 3.3.3 纳尔逊棉（C 组）端粒FISH 核型
• 3.3.4 雷蒙德氏棉（D 组）端粒FISH 核型
• 3.3.5 索马里（E 组）端粒FISH 核型
• 3.3.6 长萼棉（F 组）端粒FISH 核型
• 3.3.7 比克氏棉（G 组）端粒FISH 核型
• 3.3.8 二倍体棉之间核型的比较
• 3.4 讨论
• 3.4.1 利用FISH 技术辅助棉花的核型分析
• 3.4.2 二倍体棉花的核型特征
• 3.4.3 关于棉花变异和进化趋的研究方法及其结论
• 3.4.4 二倍体棉的核型变异和进化趋向及棉属的起源与进化
• 第四章 A 组棉基于粗线期 FISH 的细胞学图初步构建
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 酶与试剂
• 4.1.3 FISH 探针的制备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 棉花粗线期的制备
• 4.2.2 棉花粗线染色体的FISH 流程
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 适用于FISH 的的棉花粗线期染色体的制作
• 4.3.2 基于粗线期FISH 的亚洲棉细胞学图的构建
• 4.3.3 基于粗线期FISH 的草棉细胞学图的构建
• 4.4 讨论
• 4.3.1 粗线期染色体的制片及其FISH 优越性
• 4.3.2 棉花染色体编号的问题
• 4.3.3 A 组棉中期和粗线期染色体的核型比较
• 4.3.4 棉花基因组测序及分子细胞学遗传图的构建和展望
• 第五章 全文结论
• 5.1 结论
• 5.2 进一步工作的设想
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历