论文摘要
研究背景肺癌是当今世界上对人类健康危害最大的恶性肿瘤,全国肺癌协会最新发布的调查资料显示我国肺癌的发病率已高居各类恶性肿瘤首位。小细胞肺癌发病率约占全部肺癌患者的25%。尽管小细胞肺癌患者对目前临床应用的化疗药物（如etoposide,cyclophosphamide,placlitaxel等）反应敏感,但由于极易出现抗药性,化疗效果常常不理想,以致小细胞肺癌的复发率很高,临床预后差,一般2年存活率不足5%,90%的患者多在在确诊后5年内死亡。因此,化疗抗药性已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的问题之一。研究发现癌细胞逃避化疗药物诱导的细胞凋亡是化疗抗药性产生的决定性因素。因此,研究癌细胞逃避凋亡的机制成为阐明化疗抗药性的关键。细胞能否发生凋亡由抑癌细胞凋亡和促癌细胞凋亡基因间的平衡控制,化疗药物能诱导癌细胞凋亡,而一旦某种或多种凋抑制基因过表达或促进基因受到抑制,细胞就不会发凋亡,癌细胞逃避诱导而出现耐药性。在众多凋亡相关基因中,已发现与肿瘤化疗抗药性有关的基因包括Bcl-2、P53等。Bcl-2基因是一种原癌基因,它具有抑制凋亡的作用,基因转染的实验已证实Bcl-2蛋白能阻止多种因素介导的凋亡。Bcl-2抑制凋亡机制主要是:①作为抗氧化剂,调节细胞氧化还原状态,阻断氧化作用对细胞组成成分的破坏;②影响细胞跨膜转运,改变钙离子分布,钙离子激活内源性内切酶和谷氨酰转移酶,二者在细胞核凋亡时起重要作用;③抑制有促凋亡作用的细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,从而通过线粒体途径引起DNA片段化而发生凋亡;④保护免受核酸酶损害,抑制NDA断裂。然而Bcl-2并不是单独起作用的,Bcl-2可与Bax形成异源二聚体,二者的比例是决定细胞凋亡的关键。还有研究发现突变型P53能抑制Bcl-2转录起始并能降低其转录后mRNA的稳定性,从而对Bcl-2的表达进行负调节。有人推测Bcl-2与Survivin有结构相似的启动子,可能有共同的转录激活机制,协同发挥抗凋亡效应。有研究发现Bcl-2的表达与血管生成促进因子VEGF、bFGF的表达呈正相关,Bcl-2通过促进肿瘤血管生成,进而增加肿瘤细胞的生存能力。P53基因编码P53蛋白,是广为人知的肿瘤抑制基因。P53蛋白有393个氨基酸组成,具有特异的转录激活作用。当DNA损伤时,例如,细胞受到药物作用后,细胞主要反应之一便是P53蛋白的增加。它诱导CKI-P21WAF1/CIP1的转录,使细胞停滞在G1期,阻止DNA合成,同时诱导DNA修复基因GADD45的转录,修复DNA的损伤。如果G1停滞不能实现,则P53诱导细胞凋亡,防止损伤的DNA传递给子代细胞。50%的肿瘤有P53基因的突变。在肿瘤发生过程中,P53通常被灭活,其原因可能是在肿瘤发生过程中P53基因缺失、点突变,P53抑制物MDM-2的高表达,某些肿瘤病毒编码的蛋白质与P53的结合,P53被阻止不能进入核内发挥的作用。尽管凋亡相关基因如Bcl-2、P53等在细胞凋亡调控中的作用机制研究已经取得重大进展,但其上游调控基因的调控通路尚未十分清楚,已有研究表明酪氨酸激酶在细胞凋亡的调控通路中可能起重要作用。Btk家族是近年来研究较多的与T、B淋巴细胞增殖分化关系密切的一大类非受体酪氨酸激酶。上皮和内皮细胞酪氨酸激酶（epithelial and endothelialtyrosine kinase,etk）又名骨髓X激酶（bone marrow X kinase）是Btk家族（BTK/AKT,ITK/EMT/TSK,ETK/BMX,TEC）中的重要成员之一。Etk基因是Tamagon L等1994年最初从人骨髓细胞发现并克隆的,它编码一种80KD的蛋白,定位于染色体Xp22.2,介于DXS197和DXS207之间。Bmx cDNA由一段包含675个氨基酸构的开放阅读框框架组成。Etk与Btk家族的其他成员在结构上有极大的相似性,包括4个结构域,从氨基端起依次是PH（pleckstrinhomology）,SH3（SRC homology 3）,SH2（SRC homology 2）,及羧基端的激酶域。Etk激酶是Btk家族中唯一除分布于淋巴造血细胞外,还在上皮细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶。尽管Etk在上皮细胞中的表达水平不高,但研究发现它在上皮的增殖、分化、凋亡和肿瘤的发生过程中起着重要调控作用:Lee等人发现Etk在神经营养生长因子诱导的前列腺癌细胞的生长中起着重要作用,Qiu证实Etk参与了IL-6介导的前列腺癌细胞的分化。Liang等发现Etk表达增加能抑止Thapsigangh（TG）和电离（PDT）诱导的前列腺癌细胞的凋亡。Guo等通过免疫组织化学技术发现Etk有可能在部分病例中参与了鼻咽黏膜上皮分化的调节。基于酪氨酸激酶Etk在前列腺癌细胞凋亡调控中的作用,本实验通过一系列免疫组织化学染色和分子生物学实验,研究Etk在小细胞肺癌细胞中表达及与凋亡相关蛋白Bcl-2、P53之间的关系,探讨Etk在小细胞肺癌细胞凋亡过程中所起的作用及可能的信号调节途径。目的本研究选择小细胞肺癌作为研究对象,采用细胞培养,免疫组织化学染色,Western blot,质粒转染,流式细胞术,MTT细胞增殖等技术,分析Etk对小细胞肺癌凋亡（阿霉素药物诱导）的调节作用及与Bcl-2、P53等凋亡相关基因的关系,探讨Etk调控小细胞肺癌凋亡的可能机制。材料和方法1.应用免疫组织化学染色技术检测肺组织（正常肺组织,肺腺癌,肺鳞癌、小细胞肺癌）Etk,小细胞肺癌组织Bcl-2、P53的表达。2.流式细胞仪检测NCI-H446细胞中Etk表达的阳性率。3.利用LipofectamineTM2000将质粒Etk和Etk-WT转染至NCI-H446细胞,转染后细胞用含有G418培基筛选,得到稳定高表达Etk激酶蛋白的NCI-H446 WT细胞株。4.MTT细胞增殖实验选择药物浓度（IC50）,建立阿霉素诱导细胞凋亡模型。5.MTT方法比较转染前后细胞在阿霉素诱导细胞凋亡时的凋亡率。6.Western blot技术检测NCI-H446,NCI-H446 WT,NCI-H446阿霉素,NCI-H446 WT阿霉素,四种细胞Etk,Bcl-2、P53蛋白的表达。7.统计学分析:统计分析软件为SPSS11.5版。免疫组织化学染色小细胞肺癌组织Etk与P53阳性率的比较,小细胞肺癌Etk与Bcl-2阳性率的比较,不同肺癌组织Etk阳性率的比较均采用χ2检验,P≤0.05有显著性差异。结果1.196例肺组织标本（包括鳞状细胞癌44例、腺癌56例、小细胞癌71例,正常肺组织25例）肺癌组织Etk阳性表达率为54.71%,其中非小细胞肺癌（NSCLC）包括鳞状细胞癌和腺癌细胞中的表达率分别为34.09%和44.64%,小细胞肺癌为74.64%,Etk在小细胞肺癌中的表达率明显高于NSCLC（P＜0.05）,鳞癌和腺癌细胞间的表达无显著性差异性（P＞0.05）,正常肺泡和支气管上皮细胞Etk为阴性。2.71例小细胞肺癌组织标本中,Etk阳性率为74.64%（53/71）,P53阳性率60.56%（43/71）,Bcl-2阳性率54.93%（39/71）统计学分析表明Etk与P53、Bcl-2阳性率均有显著相关性。3.获得了稳定高表达Etk的细胞株NCI-H446 WT,流式细胞仪检测显示NCI-H446、NCI-H446 WT及空载体转染对照细胞的Etk蛋白表达率分别为26.31%、28.56%及76.87%。Western Blot结果显示NCI-H446 WT细胞的Etk蛋白表达明显高于NCI-H446细胞。4.成功建立阿霉素诱导细胞凋亡模型,50%小细胞肺癌细胞凋亡时,阿霉素的浓度为5.613μg/ml.5.不同浓度阿霉素作用NCI-H446,NCI-H446 WT两种细胞时,NCI-H446 WT较NCI-H446细胞凋亡率低。6.阿霉素作用细胞24小时后,Western Blot发现NCI-H446 WT细胞中Bcl-2蛋白表达较NCI-H446增强更显著,NCI-H446细胞中P53蛋白表达增强不及NCI-H446 WT细胞中P53增强明显。结论1.酪氨酸激酶Etk在小细胞肺癌组织中的阳性表达率明显高与肺鳞癌和肺腺癌,Etk有望作为小细胞肺癌的分子标记物和基因治疗的靶点。2.Etk、Bcl-2和P53在小细胞肺癌组织高表达,Etk与Bcl-2及P53阳性率均有显著相关性。3.Etk有抵抗阿霉素诱导的小细胞肺癌细胞凋亡的作用。4.Etk抵抗阿霉素诱导的小细胞肺癌细胞凋亡作用可能是通过促进Bcl-2表达和抑制P53的活性完成的。
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相关论文文献
- [1].ETK调节膀胱癌细胞侵袭转移的机制[J]. 实用医学杂志 2013(14)
- [2].Etk敲除及过表达细胞株构建并探讨Etk对细胞增殖的影响[J]. 现代生物医学进展 2020(05)
- [3].酪氨酸激酶Etk与肿瘤[J]. 医学综述 2008(19)