论文题目: 花粉特异表达的微管结合蛋白SB401的特性分析
论文类型: 博士论文
论文专业: 植物学
作者: 黄淑莉
导师: 袁明
关键词: 微管,微管结合蛋白,微丝,花粉特异表达蛋白,马铃薯
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 微管结合蛋白对微管骨架的组织和功能调控有重要的作用。马铃薯(Solanum berthaultii)花粉中特异表达的SB401蛋白具有类似于动物微管结合蛋白MAP1B微管结合域的特征重复序列,其中的KKEE基序(motif)也存在于微丝成束蛋白Villin头部(headpiece)的微丝结合域中,因此推测其具有与微管、微丝结合的能力,可能是一种新的植物花粉特异表达的微管结合蛋白。 本研究构建了SB401的原核表达载体,并通过原核表达,分离、纯化到SB401的融合蛋白,对该蛋白的微管和微丝的结合、成束以及调控微管和微丝的效应进行了系统的研究。共沉淀实验以及激光共聚焦显微镜和电镜观察结果表明:SB401蛋白可与微管特异结合,结合的摩尔比为tubulin dimmer:SB401=1;0.4;SB401蛋白诱导taxol稳定的微管形成微管束,其成束能力依赖于SB401蛋白的浓度,随SB401蛋白浓度升高,微管束从单束到交连成网团状,成束现象越来越显著;微管束中微管与微管之间由SB401蛋白紧密粘结,微管与微管之间的距离约6-8 nm,微管之间发现明显的丝状横桥结构存在。SB401蛋白在溶液中主要以单体、二聚体、四聚体形式存在,三种形式都可与微管结合,诱导微管成束。通过免疫印迹、GST融合蛋白沉降技术、350 nm浊度测定和荧光显微镜观察等方法证明SB401蛋白与微管蛋白(tubulin)特异结合。在SB401蛋白与微管蛋白的共聚合体系中,SB401蛋白能够促进或抑制微管的体外聚合,在高温(37℃)或高浓度条件下,SB401蛋白与微管蛋白迅速结合,降低了聚合反应体系中游离微管蛋白的浓度,抑制微管的聚合;在较低温度(28℃)和低浓度条件下,SB401蛋白优先与微管结合,诱导微管成束稳定微管,促进微管的聚合。细胞免疫荧光的实验也证明,SB401蛋白在花粉管中与微管共定位。 SB401蛋白也与微丝特异结合,结合的摩尔比为G-actin:SB401=1:0.22。SB401蛋白诱导微丝形成微丝束,但微丝成束需要的时间比微管成束时间长。SB401蛋白对微丝的聚合动态没有影响。在微管和微丝同时存在的条件下,SB401蛋白可与微管微丝同时结合,形成微管一微丝束,使微管微丝共定位。微管、微丝与SB401蛋白的结合有竞争性,SB401蛋白与微管的亲和力高于微丝,SB401蛋白优先与微管结合。 本论文证明了SB401蛋白是一个新发现的植物花粉特异表达的微管结合蛋白,具有诱导微管成束,调节微管聚合特性的功能;此外,SB401蛋白也可以结合微丝,诱导微丝成束。因此,SB401蛋白可能在植物花粉发育和花粉管生长等生理过程中有重要的作用。
论文目录:
目录
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英文摘要
缩略词
第一章 文献综述
1.1 微管
1.1.1 微管及微管蛋白
1.1.2 微管体外聚合的动态特性
1.1.3 微管结合蛋白
1.1.4 植物细胞中的微管结合蛋白(microtubule associated proteins-MAPs)
1.2 微丝
1.2.1 单体肌动蛋白(G-actin)和丝状肌动蛋白(F-actin)
1.2.2 肌动蛋白结合蛋白(actin-binding protein，ABPs)
1.3 植物细胞中既可与微管结合又可与微丝结合的蛋白
1.3.1 EF-1α
1.3.2 MAP-190
1.4 花粉及花粉管中的骨架系统
1.4.1 花粉管中的微丝骨架系统
1.4.2 花粉管中的微管骨架系统
1.4.3 微管、微丝在细胞极性生长过程中的作用
1.5 本课题研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 微管蛋白(tubulin)、肌动蛋白(G-actin)的提取与纯化
2.1.1 微管蛋白(tubulin)的纯化与标记
2.1.2 肌动蛋白(G-actin)的纯化
2.2 SB401蛋白原核表达载体的构建及蛋白的表达与纯化
2.2.1 SB401蛋白原核表达载体的构建
2.2.2 SB401蛋白的原核表达与纯化
2.3 SB401蛋白与微管、微丝相互作用研究的实验方法
2.3.1 taxol稳定的微管的制备
2.3.2 phalloidin稳定的微丝的制备
2.3.3 SB401蛋白与微管、微丝结合的共沉淀分析
2.3.4 SB401蛋白诱导微管、微丝成束的激光共聚焦显微镜观察分析
2.3.5 盐对SB401诱导成束的微管、微丝的作用分析
2.3.6 电镜样品制备及观察
2.3.7 SB401寡聚体分析的EDC交联和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3.8 SB40蛋白与微管蛋白作用研究的点印迹和GST-SB401融合蛋白沉降技术
2.3.9 SB401蛋白对微管聚合解聚动态作用研究的浊度分析
2.3.10 SB401蛋白对微丝聚合动态作用研究的荧光光度分析
2.3.11 SB401蛋白对微丝聚合动态作用研究的共沉淀法分析
2.3.12 GTP对SB401蛋白诱导微管成束活性的调节
2.3.13 马铃薯花粉细胞免疫荧光实验
2.3.14 实验所用常规试剂的配制
2.3.15 主要仪器设备
2.3.16 实验中所用的主要化学试剂生产厂家
第三章 结果与分析
3.1 微管蛋白(tubulin)、肌动蛋白(G-actin)的提取与纯化
3.2 原核表达载体的构建及原核表达SB401蛋白的提取与纯化
3.2.1 原核表达载体的构建
3.2.2 原核表达SB401蛋白的提取与纯化
3.2.3 SB401蛋白在不同凝胶浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率
3.3 SB401蛋白与微管结合
3.4 SB401蛋白诱导taxol稳定的微管形成微管束
3.5 SB401蛋白在体外条件下可以形成寡聚体结构
3.5.1 SB401蛋白在体外条件下形成寡聚体结构
3.5.2 二硫键是SB401蛋白形成二聚体的主要化学键
3.6 SB401蛋白与微丝结合
3.7 SB401蛋白诱导微丝形成微丝束
3.8 SB401蛋白同时结合微管与微丝，诱导形成微管-微丝束
3.9 SB401蛋白与微管蛋白结合
3.10 SB401蛋白调节体外微管聚合解聚动态
3.11 SB401蛋白对微丝聚合动态的影响
3.12 GTP对SB401蛋白诱导微管成束活性的调节
3.13 SB401蛋白在花粉管中的分布
第四章 讨论
4.1 SB401蛋白是一个花粉特异表达的植物微管结合蛋白
4.2 SB401蛋白可能在花粉管生长中具有重要生理功能
4.3 SB401蛋白与微管、微丝结合特性
4.4 SB401蛋白对微管体外聚合动态的调节
4.5 SB401蛋白在不同浓度SDS-PAGE中表观分子量比实际分子量偏大的原因分析
第五章 结论
参考文献
致谢
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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