呼吸道合胞病毒感染对大鼠脊髓背根神经节转录因子活性的影响

论文摘要

目的:在研究RSV感染后气道神经源性炎症和气道神经可塑性致气道高反应性的基础上,研究呼吸道合胞病毒（RSV）感染后大鼠脊髓背根神经节神经元转录因子的表达变化,筛选可能与气道神经可塑性相关的转录因子,进一步从细胞内信号转导和转录调控机制深入探讨气道神经可塑性的细胞内调控机制,阐明气道神经可塑性导致气道高反应性和哮喘的机理,为哮喘的防治探索一条新的途径。方法:RSV病毒株接种于铺满单层Hela细胞的细胞培养瓶中,待病变达100%时收获病毒。-70℃保存备用。收集无病毒的Hela单层细胞培养瓶中培养基上清液和细胞溶解产物,从而获得病毒基质作为阴性对照。进行感染性（50%组织细胞发生病变的感染剂量即TCID50/0.1ML）的测定（毒力测定）。1-2周龄SD大鼠（湖南省农业大学动物部）随机区组分为2组,每组30只。1组:空白对照组:2组:RSV感染组①对照组（30只）,用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,每一个鼻孔内滴入0.4u/g无病毒培养基。②RSV感染组（30只）,用2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,在每一个鼻孔内滴入0.4ul/g滴度为5X104TCID50/0.1ML的RSV病毒悬液。以上操作每周重复一次。两组第8周按编号后抽签方法将其中5只大鼠进行气道反应性测定,气道反应性测定后,取左肺,HE染色观察病理改变,行免疫组化染色检测,在冰面上迅速剖取脊髓背根神经节C7-T5于冻存管中,保存于液氮中。原位杂交法检测肺组织RSV蛋白的存在,免疫组化检测气道、神经节SYN、NF的表达,用转录因子活性芯片初步筛选调控气道神经可塑性的信号转录因子,western blot检测EGR-1在肺组织和脊髓背根节的表达变化。结果:（1）实验组大鼠渐出现卡他性鼻炎、呼吸气促、毛乱、活动度降低的临床表现,实验组大鼠与对照组大鼠在平均体重差异无显著性,体温差异有显著性（P＜0.05）。（2）实验组大鼠吸入梯度浓度组胺后气道阻力明显高于正常对照组,差异有显著性（均P＜0.05）,说明存在气道高反应性。（3）光镜下实验组大鼠肺组织符合典型间质性肺炎的病理改变。（4）实验组气道壁、神经节中SYN、NF蛋白表达平均阳性系数显著高于对照组（P＜0.05）。（5）利用TranSignal蛋白/DNA组合芯片（345）检测筛选:RSV反复感染引起大鼠C7-T5背根节345个转录因子中的55个表达上调2倍以上,43个表达下调2倍以上。（6）western blot检测EGR-1在肺部和脊髓背根节细胞的表达变化,结果显示EGR-1在RSV感染组表达明显低于对照。结论:（1）采用RSV滴鼻的方式建立SD大鼠气道高反应性模型,能成功复制出气道高反应性大鼠模型。（2）反复呼吸道合胞病毒感染引起幼鼠气道神经网络发育异常改变（神经可塑性改变）。（3）转录因子活性芯片初步筛选出了反复呼吸道合胞病毒感染后脊髓背根节神经元细胞内发生活性改变的转录因子98种,为进一步探索反复呼吸道合胞病毒感染后气道神经可塑性变化的关键转录因子提供了研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 前言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 RSV病毒悬液制备及毒性检测
• 1.2.2 SD大鼠RSV感染模型的建立
• 1.2.3 观察指标
• 1.2.4 HE染色光镜观察支气管肺的病理改变
• 1.2.5 原位杂交法检测大鼠肺组织中RSVmRNA的表达
• 1.2.6 免疫组化染色法检测大鼠气道SYN、NF的表达
• 1.2.7 转录因子活性芯片初筛调控气道神经可塑性的关键转录因子
• 1.2.8 Western blot分析EGR-1的表达:
• 1.2.9 统计方法
• 第二章 结果
• 2.1 RSV感染滴定结果
• 2.2 RSV感染对大鼠一般状况的影响
• 2.3 大鼠气道反应性的测定
• 2.4 HE染色光镜病理检查
• 2.5 原位杂交（ISH）检测RSV mRNA的存在
• 2.6 免疫组化检测SD大鼠气道突触素、神经丝的表达
• 2.7 免疫组化检测C7-T5背根神经节SYN、NF的表达
• 2.8 转录因子活性芯片对调控气道神经可塑性的细胞内关键转录因子进行初步筛选
• 2.9 RSV反复感染致肺组织、T7-T5背根节EGR1含量变化情况
• 第三章 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间研究成果