热纤梭菌的纤维小体酶活性及遗传改造研究

论文摘要

化石燃料的日益枯竭、环境污染、气候变化等问题日益严重,以纤维素乙醇等为代表的新能源备受瞩目。整合生物加工工艺（Consolidated Bioprocessing,CBP）实现了低成本的乙醇工业生产,其关键是得到高效的发酵菌种。热纤梭菌（Clostridium thermocellum）等嗜热厌氧菌因成本低廉、环保高效,在CBP中潜力巨大,但因乙醇产量较低,耐抑制物能力不足,尚难以满足工业化的要求,需要进行遗传改造。以此为目标,本研究拟解决以下问题:（1）优化条件以得到最大的热纤梭菌纤维小体（cellulosome）酶酶活;（2）摸索适用于热纤梭菌的遗传转化技术,并于中温的解纤维梭菌H10（Clostridium cellulolyticum H10）中做进一步验证;（3）诱变筛选能够耐受超过5%（v/v）乙醇的热纤梭菌突变株。在一系列浓度梯度下,验证纤维素预处理及发酵产生的物质对纤维小体酶活性的影响。结果发现:第一,甲酸盐、乙酸盐和乳酸盐能够提高纤维小体的活性;第二,纤维小体能够耐受最高5mM的糠醛、50mM的p-对羟基苯甲酸和1mM的儿茶酚;第三,纤维小体比真菌（里氏木霉）纤维素酶具有更好的乙醇耐受性和热稳定性。将上述条件用于热纤梭菌JYT01的纤维素发酵,得到了491mM的乙醇,是报道的热纤梭菌纤维素单菌发酵的最高产量。遗传转化是进行热纤梭菌基因改造的前提,为了提高转化效率,用异烟肼诱导制备热纤梭菌LQR1的感受态,当场强达到15-18kV/cm时,成功的将荧光标记葡聚糖（Texas red-conjugated dextran）转入细胞。解纤维梭菌H10的电转化结果显示,转化率接近102 pfu/μg DNA（pIKM1）,有希望在该菌中验证热纤梭菌LQR1的遗传改造策略。鉴于热纤梭菌LQR1野生菌的乙醇耐受性≦1%（v/v）,难以满足工业化的要求（5%,v/v）,通过EMS诱变筛选了三株突变菌,均能最高耐受6%（v/v）的乙醇,且生长状况良好。其中编号为热纤梭菌M1560、M1530的两株菌乙醇产量均不低于野生菌。综上所述,本研究优化了纤维小体的活性条件,在热纤梭菌的单菌发酵中得到了报道中最高的乙醇产量;摸索了热纤梭菌LQR1及解纤维梭菌H10电转化条件并诱变筛选了三株乙醇耐受突变株。这些发现不仅为纤维素乙醇提供了新的设计、选择、优化思路,也为将来嗜热厌氧菌的遗传改造奠定了基础,从而共同促进纤维素乙醇工业化的发展。

论文目录

• 论文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 原料纤维素
• 2 纤维素乙醇工业的明星菌株
• 2.1 热纤梭菌——效率极高的纤维素分解嗜热厌氧梭菌
• 2.2 解纤维梭菌——纤维素乙醇研究的模式菌株
• 2.3 纤维小体（cellulosome）
• 3 热纤梭菌对纤维素的降解途径
• 4 厌氧梭菌转化的手段及质粒载体
• 4.1 电转化构建基因工程菌的探索
• 4.2 超声转化的探索
• 5 热纤梭菌的遗传改造策略
• 5.1 代谢通路基因改造的可行性
• 5.2 乙醇耐受菌株的诱变筛选
• 第一章 热纤梭菌LQR1 纤维小体活性的影响因素
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 纤维小体的提取及其活性测定
• 1.3 有机酸、糠醛、酚和乙醇、有机酸对纤维小体活性的影响
• 1.4 纤维小体的热稳定性
• 1.5 热纤梭菌JYT01 在外加甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐时对纤维素的降解
• 1.6 发酵罐中，热纤梭菌JYT01 单菌培养的乙醇发酵
• 2 结果及讨论
• 2.1 pH及温度对纤维小体和纤维素酶活性的影响
• 2.2 有机酸离子对纤维小体和纤维素酶活性的影响
• 2.3 有机酸对纤维小体和纤维素酶活性的影响
• 2.4 乙醇、糠醛和酚对纤维小体和纤维素酶活性的影响
• 2.5 纤维小体和纤维素酶的热稳定性
• 2.6 不调节pH值时，热纤梭菌JYT01 在Hungate密封管中对纤维素的降解
• 2.7 控制反应液pH值，进行热纤梭菌JYT01 的纤维素发酵
• 3 结论
• 第二章 热纤梭菌LQR1 的遗传转化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 培养基、菌株及培养条件
• 1.2 质粒及其转化鉴定
• 1.3 在GS-2 培养液中生长曲线的测定
• 1.4 电转化
• 1.5 转化子的鉴定
• 1.6 解纤维梭菌H10 的基因敲除的准备
• 1.7 热纤梭菌LQR1 原生质体制备
• 2 结果及讨论
• 2.1 在GS-2 培养液中的生长曲线
• 2.2 以荧光标记葡聚糖对热纤梭菌LQR1 的电转化
• 2.3 以pIKM1 对热纤梭菌LQR1 的电转化中转化子的鉴定
• 2.4 以pIKM1 质粒对解纤维梭菌H10 的电转化中转化子的鉴定
• 2.5 热纤梭菌LQR1 原生质体的制备
• 3 结论
• 第三章 热纤梭菌LQR1 的乙醇耐受研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、培养条件及材料
• 1.2 热纤梭菌LQR1 乙醇耐受菌株的诱变筛选
• 1.3 热纤梭菌野生菌及突变株的形态观察
• 1.4 突变株的乙醇耐受性考察
• 1.5 突变株纤维素发酵特性的考察
• 1.6 热纤梭菌LQR1 野生菌及三突变株膜蛋白图谱的比较
• 2 结果及讨论
• 2.1 热纤梭菌LQR1 乙醇耐受突变株
• 2.2 热纤梭菌LQR1 野生菌及突变株的扫描电镜观察
• 2.3 热纤梭菌LQR1 野生菌及突变株的乙醇耐受性考察
• 2.4 乙醇耐受突变株的纤维素发酵特点
• 2.5 比较热纤梭菌LQR1 野生菌及三突变株膜蛋白图谱
• 3 总结
• 全文结论
• 参考文献
• 论文及专利
• 致谢