应用自身抗体筛选和鉴定乳腺肿瘤相关抗原

论文摘要

背景目前应用于乳腺癌检测的肿瘤标志物只有有限的几个,不但敏感性和特异性都不高,而且对乳腺癌早期检测都没有很好的效果。应用自身抗体技术筛选得到的乳腺肿瘤相关蛋白不仅有助于提高乳腺癌检测的敏感性和特异性,还能在很大程度上填补乳腺癌早期检测的空白。方法运用生物淘洗富集技术,用正常人和乳腺癌病人血清从一个乳腺癌cDNA T7噬菌体文库中筛选肿瘤相关蛋白。经生物淘洗,用噬菌斑转印分析和免疫化学检测方法得到肿瘤相关蛋白。再用PCR和测序的方法分析这些潜在的肿瘤相关噬菌体克隆,寻找在开放阅读框架内的序列,通过BLAST比对识别出这些噬菌体表达蛋白。后用酶联免疫吸附（ELISA）的方法对87个乳腺癌病人和87个正常人血清样品,检测每一个开放阅读框架内的噬菌体表达蛋白的自身抗体。为评估单个标志物和多标志物联合诊断的准确率,使用了逻辑回归模型和留一交叉验证方法。最后又从实验室保存的经四轮生物淘洗后的肺癌cDNA T7噬菌体文库中用同样的方法筛选、鉴定和分析乳腺癌相关蛋白。结果淘洗富集后我们得到了100个乳腺肿瘤相关噬菌体克隆,序列分析表明其中6个不同的噬菌体表达蛋白在阅读框架之内。BLAST比对结果与ASB-9, SERAC-1和]RELT这3个蛋白最为匹配。应用自身抗体,对这6个噬菌体表达蛋白的ELISA分析结果显示,其中3个克隆在统计学上能显著区分出病人和正常人。用87份乳腺癌病人血清和87份正常人血清对这3个噬菌体表达蛋白进行验证,逻辑回归模型联合检测的敏感性达到80%,特异性达到100%；留一交叉验证3者联合的预测值敏感性和特异性分别达到76.5%和82.4%。后从肺癌文库中筛选得到了43个乳腺肿瘤相关噬菌体克隆,经PCR挑出电泳条带明显不一样的10个产物去测序。测序结果通过NCBI核酸数据库比对得到2条开放阅读框架内蛋白序列信息。应用自身抗体,对表达HSPA4L和RINT-1这两个蛋白噬菌体的ELISA分析结果显示,这2个克隆在统计学上能显著区分出病人和正常人。随机选取87份乳腺癌病人血清和87份正常人血清对这两个噬菌体表达蛋白进行验证,逻辑回归模型联合检测的敏感性达到94%,特异性达到100%；留一交叉验证两者联合的预测值敏感性和特异性分别达到84.5%和95%。ROC曲线分析和留一法都表明多个标志物联合检测的价值要高于单标志物,意示着多标志物联合在诊断中的重要性。结论对乳腺癌来说,血清自身抗体是其早期检测和诊断的一种有效方法,而且多抗体联合应用可实现更高的诊断准确率。下一步就是如何更进一步的提高诊断准确率,以使其应用到大规模的健康普查中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 肿瘤抗原与自身抗体
• 1.2 乳腺癌和乳腺肿瘤抗原
• 1.3 免疫筛选肿瘤标志物方法
• 1.3.1 重组cDNA表达文库血清学分析
• 1.3.2 血清学蛋白质组分析
• 1.3.3 蛋白芯片技术
• 1.4 肿瘤标志物分析方法
• 1.5 研究目的及意义
• 第2章 实验材料和方法
• 2.1 主要实验材料
• 2.1.1 实验材料与试剂
• 2.1.2 培养基和缓冲液的配制
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 应用的生物信息学软件
• 2.1.4.1 DNAMAN
• 2.1.4.2 Primer Premier 5.0
• 2.1.4.3 Medcalc
• 2.1.4.4 SPSS
• 2.1.4.5 Weka
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 病人血清样本
• 2.2.2 乳腺癌文库的淘洗
• 2.2.2.1 淘洗原理
• 2.2.2.2 淘洗方法
• 2.2.2.3 淘洗后的富集
• 2.2.2.4 第4轮生物淘洗后文库滴度的测定
• 2.2.3 乳腺癌文库淘洗产物的免疫学筛选
• 2.2.4 肿瘤标志物的鉴定
• 2.2.4.1 对候选肿瘤标志物进行PCR扩增
• 2.2.4.2 序列测定
• 2.2.4.3 筛选开放阅读框架内蛋白和比对分析
• 2.2.5 噬菌体克隆标准化
• 2.2.6 单克隆标准曲线的绘制
• 2.2.7 六种乳腺癌特异噬菌体抗原的ELISA亲和性检测
• 2.2.8 统计学分析六种标志物
• 2.2.9 从肺癌文库中免疫学筛选乳腺肿瘤标志物
• 2.2.10 阳性克隆的测序及分析
• 2.2.11 HSP70和RINT-1的化学发光免疫检测
• 2.2.12 HSP70和RINT-1的ELISA亲和性检测
• 2.2.13 统计学分析HSP70和RINT-1标志物
• 第3章 实验结果与分析
• 3.1 T7噬菌体文库的生物淘洗
• 3.2 正常人和病人血清筛选乳腺癌特异蛋白
• 3.3 噬菌体表达蛋白的鉴定
• 3.3.1 PCR产物
• 3.3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定
• 3.4 噬菌体表达蛋白的抗体亲和性分析
• 3.5 六种标志物的ELISA亲和性检测
• 3.5.1 建立六种标志物的逻辑回归模型
• 3.5.2 ASB-9、SERAC-1和RELT留一交叉验证模型
• 3.6 从肺癌文库中筛选鉴定噬菌体表达蛋白
• 3.7 化学发光免疫检测HSP70和RINT-1蛋白噬菌体
• 3.8 间接ELISA验证HSP70和RINT-1
• 3.8.1 逻辑回归验证
• 3.8.2 留一交叉验证
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢