骨髓间充质干细胞对异体外周血B淋巴细胞的免疫调节作用

论文摘要

目的探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）在体外对异体外周血B淋巴细胞的免疫调节作用。方法密度梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,加入含10%胎牛血清的LG-DMEM培养液,将细胞的密度调整到2×105个/ml,接种到培养瓶中,48 h后更换新鲜培养液,以后每2～3 d换液1次。当细胞铺满培养瓶底90%以上时,按常规方法进行细胞传代培养。用流式细胞术检测培养细胞的CD3、CD4、CD8、CD13、CD22、CD33、CD34、CD44、HLA-DR表达情况。常规从外周血中分离单个核细胞,L-亮氨酸甲酯去除单核细胞,以2-氨乙基硫脲溴化物（AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）花环形成法,去除T淋巴细胞获得纯化的B淋巴细胞。用羊抗人IgM单克隆抗体（Anti-IgM）刺激与或未与MSCs及其培养上清共培养3天的B淋巴细胞,应用MTT法测B淋巴细胞的增殖,ELISA法测培养上清中免疫球蛋白IgG、IgM的产生,应用流式细胞仪分别检测与MSCs共培养24h、48h后B淋巴细胞的凋亡。结果实验中观察到,梯度离心所得单个核细胞接种2～3h细胞开始贴壁,24h后贴壁细胞数目不再增加,1～2w后开始迅速增殖,细胞多为梭形,培养至3w周左右贴壁细胞接近80%～90%融合。传代培养后,传代细胞在12～24 h内全贴壁,生长迅速,形态均一,大约7d左右达到完全融合。传代扩增细胞以流式细胞术检测,结果显示CD3、CD4、CD8、CD22、CD33、CD34和HLA-DR均表达阴性,高表达CD13,CD44。在体外活化B淋巴细胞反应体系中加入异体MSCs,显示MSCs及其培养上清抑制由丝裂原Anti-IgM诱导的B淋巴细胞的增殖,且这种抑制程度和MSCs的细胞数量及其培养上清浓度有关。体外与不同比例MSCs共培养的B淋巴细胞,MSCsⅡ（B∶MSCs10∶1）、MSCsⅢ（B∶MSCs 1∶1）组A值明显低于未加MSCs的对照组A值（均P＜0.01）,并且MSCsⅢ组A值显著低于MSCsⅠ（B∶MSCs 50∶1）组（P＜0.05）。用含有12.5%、25%、50%不同MSCs培养上清液浓度的培养基培养B淋巴细胞3d后,其中50%组A值同对照组相比有统计学意义（P＜0.05）,并且显著低于12.5%组的A值（P＜0.05）。ELISA检测显示MSCs及其培养上清液抑制B淋巴细胞分泌免疫球蛋白,并且随着MSCs数量的及其上清浓度的增加,这种抑制也越明显。与B淋巴细胞加刺激物组相比,B∶MSCs 1∶1组及50%super组分泌的IgM明显减少（P＜0.01）,而只有B∶MSCs 1∶1组分泌的IgG同对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。MSCs不诱导B淋巴细胞的凋亡;B淋巴细胞与MSCs共培养24h、48h,加或不加Anti-IgM,各组间细胞凋亡率组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。MSCs对B淋巴细胞的抑制具有可逆性。收集和MSCs共培养3d的B淋巴细胞,重新用Anti-IgM刺激增殖,与未加Anti-IgM的共孵B淋巴细胞组A值相比,二者间差异有统计学意义（P＜0.0）。结论MSCs对异体外周血B淋巴细胞存在免疫调节作用,并且这种调控机制是复杂的,不仅与MSCs细胞数量有关,还与细胞间的相互作用和MSCs分泌的细胞因子有关。

论文目录

• 中文摘要
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• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 攻读学位期间研究成果
• 致谢