AQP2在子宫内膜异位症发病机制中作用的研究

论文摘要

子宫内膜异位症是生育年龄妇女的常见病,在普通人群中的发病率高达3%-10%,在伴有慢性盆腔疼痛的妇女中达5%-20%,在不孕症患者中高达20%-40%。严重影响了妇女的生活质量。子宫内膜异位症主要临床表现为慢性盆腔疼痛、痛经、性交疼以及不孕等。子宫内膜异位症尽管是一种良性疾病,却表现出类似恶性肿瘤的一些特征,如异常的细胞迁移、种植、侵袭以及血管生成。经血逆流在月经期的妇女中普遍存在,但是子宫内膜异位症仅存在于不到10%的生育年龄妇女中,越来越多的研究显示,在位内膜的内在缺陷导致子宫内膜的异位种植。有研究表明：子宫内膜异位症患者中,存在异常的细胞因子、血管生成因子以及一些肿瘤相关因子的表达异常,这些异常表达的因子导致了子宫内膜异位症的发生发展。水通道蛋白（aquaporin, AQP）是一种选择性水转运蛋白,相对分子量约30KD,广泛存在于人体的大部分组织和器官。自从1988年Agre首次报道水通道蛋白后,迄今为止,已从哺乳动物中鉴定出13种水通道蛋白。我们以往的研究表明,AQP1和AQP2在子宫内膜上有表达,其中,AQP2主要表达与子宫内膜的腔上皮和腺上皮,AQP1主要表达与子宫内膜的微血管和小血管。AQP1/AQP2的表达存在月经周期依赖性,增生期表达最高,其次是分泌中期,推测雌激素可能通过其受体调节了子宫内膜细胞AQP的表达。AQP1在无排卵性功能性宫血以及原发性月经过多的患者的子宫内膜表达异常,提示AQP1在血管生成以及微血管的修复有关。我们研究小组还发现AQP1在子宫内膜腺样癌患者的子宫内膜血管和微血管中表达异常,AQP1的表达量与肿瘤的侵袭、转移、临床分级和分期呈正相关。近来,有很多研究表明,AQPs在很多肿瘤组织中表达异常,并且与肿瘤的转移和分级密切相关；有的研究者甚至提出,AQPs在肿瘤组织中的表达具有诊断和预后价值。所有以上的研究提示,AQP依赖的细胞迁移是一种普遍现象,与细胞的种类和AQP的类型无关。我们的研究发现,子宫内膜异位症患者的子宫内膜AQP2的表达明显高于对照组。体外实验显示,雌激素上调了AQP2的表达,并且存在剂量依赖性,雌激素的这种上调作用可被雌激素受体阻断剂ICI1821780所阻断,我们的研究,还进一步表明,在AQP2的启动子区域存在雌激素反应元件（Estrogen receptor element,ERE）,雌激素通过雌激素反应元件直接调节了AQP2的表达。通过小RNA干扰技术,我们发现AQP2参与了细胞的粘附、迁移以及侵袭。我们还观察到AQP2的表达上调或下调将引起钙结合蛋白annexin2以及骨架蛋白F-actin的表达异常,从而引起骨架蛋白的重构和细胞形态的变化。我们假定雌激素上调AQP2的表达,AQP2表达上调通过细胞骨架的重构而影响细胞的粘附、迁移和侵袭。因此,我们推测,子宫内膜异位症患者在位内膜AQP2的表达异常,参与了子宫内膜细胞的异位粘附,异常细胞迁移和侵袭过程,在子宫内膜异位症的发病机制中起重要作用。第一部分AQP2在人子宫内膜异位症在位组织中的表达、分布目的：了解AQP2在人子宫内膜异位症患者在位内膜组织上的表达,比较与正常育龄期妇女在位内膜的表达。方法：对44例子宫内膜异位症患者的在位子宫内膜和37例管性不孕患者在位子宫内膜组织采用qRT-PCR法,Western blotting法半定量检测AQP2的表达水平。用免疫组化法检测AQP2在子宫内膜的定位。结果：1.在44例中子宫内膜异位症患者在位内膜AQP2 mRNA和蛋白水平上的表达明显高于37例管性不孕患者在位子宫内膜中AQP2 mRNA和蛋白的表达（p<0.05）。2.免疫组化显示AQP2主要定位于子宫内膜细胞的腺上皮和腔上皮。结论：子宫内膜异位症患者的在位内膜AQP2的表达明显高于正常对照组在位内膜AQP2的表达。第二部分17β-雌二醇调节子宫内膜细胞AQP2的表达目的：探讨雌激素是否直接参与了AQP2表达调节及其机制。方法：1.体外实验以子宫内膜细胞系为研究对象,通过不同浓度的雌激素和或同时加入雌激素受体阻断剂处理细胞,采用qRT-PCR和Western blotting检测细胞中AQP2的表达。2. AQP2 promotor-pGL3重组质粒构建,质粒转染到子宫内膜细胞,培养后裂解细胞,荧光素酶活性检测。结果：1.E2能够明显上调AQP2的表达,并且呈现出剂量依赖性；雌激素受体阻断剂ICI182780能够阻断E2对AQP2表达的上调作用。2. AQP2 promotor S2区域存在ERE结构,在子宫内膜细胞中,E2通过ERE调节AQP2的表达。结论：在子宫内膜细胞中,雌激素通过雌激素反应元件直接调节了子宫内膜细胞AQP2的表达。第三部分AQP2在细胞增殖、粘附、迁移和侵袭中的作用目的：通过小RNA干扰技术研究AQP2在细胞增殖、粘附、迁移和侵袭中的作用。方法：雌激素和或AQP2 siRNA处理培养细胞,采用Alarmblue,细胞划痕实验,transwell小室实验等方法,检测细胞的增殖、细胞粘附、细胞迁移以及细胞侵袭能力。结果：1.E2能够明显促进细胞的粘附,迁移和侵袭能力,AQP2 siRNA后,细胞粘附,迁移和侵袭能力明显下降,E2和siRNA同时处理,E2对细胞粘附,迁移和侵袭能力的促进作用可被siRNA干扰部分阻断。2.E2增加了细胞的增殖能力；AQP2 siRNA干扰对细胞的增殖能力没有影响。结论：雌激素通过上调AQP2的表达而促进了子宫内膜细胞的粘附、迁移和侵袭力。第四部分AQP2通过annexin 2介导的细胞骨架蛋白的表达以及重构而改变细胞的迁移和侵袭能力目的：探讨AQP2变化引起的细胞迁移能力的改变与Annexin2以及F-actin的关系。方法：采用扫描电镜观察细胞形态,免疫共聚焦观察细胞骨架形态,westen-blot检测annexin2以及F-actin的表达情况结果：E2能够上调annexin2的表达和F-actin的表达,AQP2 siRNA干扰之后, annexin2以及F-actin的表达下调,E2和AQP2 siRNA同时处理后,AQP2 siRNA干扰所产生的annexin2以及F-actin的表达下调的作用可被E2挽救。结论：AQP2影响子宫细胞的粘附、迁移和侵袭能力是通过调节钙调节蛋白annexin和纤维肌动蛋白F-actin的表达和F-actin重构实现。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 目次
• 引言
• 参考文献
• 第一部分 AQP2在子宫内膜异位症患者在位内膜以及正常妇女在位内膜组织中的表达
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 17β-雌二醇调节子宫内膜细胞AQP2的表达
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 AQP2在细胞增殖、粘附、迁移和侵袭中的作用
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 AQP2通过annexin 2介导的细胞骨架蛋白的表达以及重构而改变细胞的迁移和侵袭能力
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果