不同限制性输液方案复苏孕兔非控制性失血性休克的研究

论文摘要

背景对急性产科出血性休克病人,容量复苏是院前生命高级支持系统的重要组成部分。近年来,大量的临床和动物实验证明出血未控制前不适当的液体复苏可能恶化休克的结局,一些有关创伤性失血性休克早期救治临床实践指南和部分国家的治疗规范已从传统的快速输液复苏转向一个更为理性、明智的限制性输液复苏治疗。限制性输液是指机体处于有活动出血的失血性休克时,通过控制液体输注速度和输液量,保持机体血压维持在一个能有效保障重要器官血供的较低水平范围,从而减少再出血。2006年巴黎国际会议推荐:对于外伤性失血性休克,在外科手术未有效控制出血前复苏平均动脉压至40mmHg;其他类型的休克推荐复苏的目标血压为MAP＞65 mmHg。限制性输液复苏明显地减少了休克并发症,改善休克的治疗效果,在临床创伤失血性休克救治中的应用已取得良好的疗效。产科休克是与妊娠和分娩所致产后出血直接相关的休克,是威胁孕产妇生命的首要原因,鉴于产妇本身独特的血流动力学生理特性如高血容量、高凝状态,处于非控性出血状态的孕产妇院前抢救能否应用限制性输液复苏?在产科领域国内外未见报道。余艳红教授课题组自2004年开始对限制性输液复苏孕产妇失血性休克进行了动物实验研究,发现限制性输液复苏孕兔失血性休克优于传统快速容量复苏,能明显地改善休克孕兔的血流动力学,减少出血量,提高存活率,与创伤领域研究结果相一致。然而围绕适宜的复苏血压、合理的输液量、理想的复苏液体、复苏的终点特别是出血未控制前院前处理等问题还有待深入探讨。本研究拟在前期研究基础上采用随机、前瞻性实验方法观察限制性输液特别是不同种类的液体复苏孕兔失血性休克模型对微循环灌注、缺血再灌注、能量代谢、全身炎症反应综合症等各方面的影响,进一步了解妊娠期失血性休克的病理生理机制的影响,寻找适宜复苏血压、时机及输液种类,提供限制性输液应用于产科失血性休克治疗的实验数据,为后期临床研究提供可靠依据,以提高抢救失血性休克的成功率,降低孕产妇死亡率。第一章不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克微循环的影响【目的】失血性休克治疗后出现大循环和微循环血流不一致的分离现象,治疗后毛细血管无复流使功能毛细血管密度（FCD）下降,FCD的恢复是决定休克预后的重要指标。我们应用孕兔非控制性失血性休克模型研究不同的液体复苏方案对孕兔失血性休克时对孕兔耳窗微循环、血液动力学、系统代谢和生存情况的影响,通过比较不同液体限制性输液对孕兔失血性休克微循环灌注的影响,寻找理想的复苏液体。【方法】1、建立孕兔失血性休克模型及微循环耳窗模型:经过麻醉动物、备皮、颈动静脉插管、耳窗制作术后,沿下腹部正中切口打开腹腔,暴露子宫,制作孕兔失血性休克模型。模型分为4期:①基础期（Base stage,Omin）麻醉、插管、耳窗制作。②急性失血期（shock stage,0～30min）:选取孕兔任意一孕囊,剪断此孕囊下方子宫系膜处的一处直径约3-4mm的动脉切断,使用无菌纱布围绕（便于统计出血量）,然后颈动脉放血,速率2ml.kg-1.min-1,使MAP在15分钟内降至40mmHg,维持其在40～45mmHg之间15分钟,抽出的血液经肝素化处理以备回输。③院前复苏期（Prehospital stage,30～90min）:急性失血期后的30～90min期间。根据预先设定的输液方案给予抢救。④院内复苏期（Hospital stage,90～180min）:当实验进行至90min后,缝扎血管彻底止血,回输血液和继续输液治疗以维持MAP在80mmHg,第180min分钟停止实验拔除各插管缝合伤口观察生存一周情况。2、实验分组:选择妊娠期为15～25天新西兰孕兔30只,将实验动物编号随机分为3组:①传统复苏组（NS resuscitation,NS）:院前复苏期开始接受大量的生理盐水（NS）及林格氏液（RS）快速输注以维持MAP在80mmHg左右;②限制性输液复苏组（NS hypotension resuscitation,NH）:院前复苏期开始接受小量RS输注以维持MAP在60mmHg左右;③高渗高胶限制性输液复苏组（hypertonic hyperosmotic hypotension resuscitation,HHH）:院前复苏期开始接受小量HHES（万汶+7.5%氯化钠,4ml/kg）及RS输注以维持MAP在60mmHg左右;各组均于院内复苏期接受手术止血和输血输液治疗,实验结束后吻合血管、缝合伤口,动物给与食物和水笼中饲养观察生存率。3、监测指标:于实验0min、30min、90min、180min并抽血检测BE、PH、PCO2、PO2和HCT水平,连续监测MAP及微循环情况。BE、PH、PCO2、PO2用全自动血气分析仪监测;血HCT采用微量血细胞比容离心机监测;微循环选择有4-6个具有4-6个毛细血管的微循环录像片段分析,FCD计数以观察30秒内毛细血管中至少有一个红细胞通过为标准;于实验180min记录各组失血量和补液量,拔除各插管缝合伤口观察生存一周情况。【结果】1.不同复苏方式孕兔pH,BE,PO2,PCO2的变化:休克后出现代偿性的过度呼吸,表现为动脉血PCO2、pH、BE的下降和PO2的上升,复苏期末限制性复苏组PCO2,PO2基本恢复正常,快速复苏组仍表现为轻度过度呼吸,NH、HHH组与NS组组间比较差异有统计学意义（F=6.199,P=0.006;F=13.045,P＜0.001）。复苏后各组PH和BE逐渐回升,院内复苏末未达到基础期水平,NH、HHH组与NS组组间比较PH和BE差异有统计学意义（F=20.894,P＜0.001;F=6.670,P=0.004）。说明限制性输液复苏可有效缓解通气过度,有利于酸碱平衡。2.不同复苏方式孕兔微动脉、微静脉直径比较:休克后微动脉、微静脉分别收缩至基础期0.63±0.54%和0.77±0.67%,复苏后微动脉直径恢复,院内复苏期末各组分别为HHH（0.92±0.04%）,NH（0.85±0.07%）和NS（0.71±0.01%）,组间差异有统计学意义（F=103.932.P＜0.001）。复苏后微静脉直径渐恢复,院内复苏期末各组分别为HHH（0.88±0.07%）,NH（0.87±0.05%）and NS（0.84±0.08%）,组间差异无统计学意义（F=2.107,P=0.141）。提示高张高胶限制性输液可以有效扩张休克时收缩的微血管,改善微循环。3.不同复苏方式孕兔功能性毛细血管密度（FCD）数目比较:休克后各组FCD数目减少到基础期的42.57±5.5%,院前复苏后,FCD渐恢复,在T90min各组间比较无统计学意义（F=40.150,P=0.000）。院内复苏后,FCD未恢复至基础期水平,在T180minFCD相对于基础期各组依次为NS组（59.70±4.81%）、NH组（70.30±5.62%）、HHH组（91.70±4.69%）,NH、HHH组与NS组组间比较差异有统计学意义（F=103.932,P=0.000）。院内期末FCD水平与生存时间呈正相关（Pearson相关系数r=0.505,p=0.004）。表明限制性输液可以促进失血性休克后毛细血管灌流恢复,高张高胶限制性输液效果更明显。4.不同复苏方式孕兔失血量、补液量、HCT、生存时间比较:院内期末失血量、补液量NH（3.79±0.39 VS37.80±4.65 ml/kg）、HHH组（3.28±0.62VS31.74±4.07ml/kg）显著少于NS组（4.54±0.83 VS44.92±3.25 ml/kg）;院内期末HCT NH组（20.50±1.96%）、NH组（20.20±1.55%）显著高于NS组（16.30±1.57%）;各组24小时、48小时、72小时各组孕兔生存率分别为NS（90%、50%、30%）,NH（100%、80%、70%）,HHH（100%、80%、80%）,差异有统计学意义,可认为三组间比较生存率有差异。各组中位生存时间NH组（3.00±0.42天）、HHH（3.40±0.48天）、NS（1.70±0.34天天）,NS组与NH（X2=5.528,P=0.019）、HHH组（X2=8.679,P=0.003）组间比较差异有统计学意义,院内期末HCT水平与生存时间呈正相关（Pearson相关系数r=0.379,p=0.03）。说明限制性输液复苏可有效地减少内出血及输液量,稳定了HCT,避免血液过度稀释,提高血液携氧能力,延长动物生存时间,增加动物生存率。【结论】不同的液体复苏方式和种类对休克后微循环的恢复和系统代谢产生不同的影响。限制性输液复苏较快速输液复苏微动脉收缩减轻,FCD数目增多,组织灌流增加,动物生存时间延长,生存率提高。高张高胶限制性输液较等渗晶体限制性输液能较明显的改善微循环、减少输液量,可望应用于院前急救。第二章不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克肺损伤的保护作用【目的】休克后由中性粒细胞激活诱发的免疫反应是组织损伤的重要阶段,中性粒细胞和其它巨噬细胞的激活引起组织损伤,最终至器官功能的障碍。应用孕兔非控制性失血性休克模型研究不同的液体复苏方案对孕兔失血性休克时肺组织MPO、血浆PAF水平的变化及早期肺组织超微结构改变,探讨不同限制性输液复苏方案对休克后免疫功能和器官损伤的影响。【方法】1、建立孕兔失血性休克模型模型:经过麻醉动物、备皮、颈动静脉插管后,沿下腹部正中切口打开腹腔,暴露子宫,制作孕兔失血性休克模型。模型分为4期:①基础期（Base stage,0min）麻醉、插管。②急性失血期（shock stage,0～30min）:选取孕兔任意一孕囊,剪断此孕囊下方子宫系膜处的一处直径约3-4mm的动脉切断,使用无菌纱布围绕（便于统计出血量）,然后颈动脉放血,速率2ml.kg-1.min-1,使MAP在15分钟内降至40mmHg,维持其在40～45mmHg之间15分钟,抽出的血液经肝素化处理以备回输。③院前复苏期（Prehospital stage,30～90min）:急性失血期后的30～90min期间。根据预先设定的输液方案给予抢救。④院内复苏期（Hospital stage,90～180min）:当实验进行至90min后,缝扎血管彻底止血,回输血液和继续输液治疗以维持MAP在80mmHg,第180min分钟停止实验。2、实验分组:选择妊娠期为15～25天新西兰孕兔18只,将实验动物编号随机分为3组:①传统复苏组（NS resuscitation,NS）:院前复苏期开始接受大量的生理盐水（NS）及林格氏液（RS）快速输注以维持MAP在80mmHg左右;②限制性输液复苏组（NS hypotension resuscitation,NH）:院前复苏期开始接受小量RS输注以维持MAP在60mmHg左右;③高渗高胶限制性输液复苏组（hypertonic hyperosmotic hypotension resuscitation,HHH）:院前复苏期开始接受小量HHES（万汶+7.5%氯化钠,4ml/kg）及RS输注以维持MAP在60mmHg左右;各组均于院内复苏期接受手术止血和输血输液治疗,实验结束后处死动物取组织待检。3、监测指标:于实验0min、30min、90min、180min抽血检测血浆PAF水平,实验结束后处死动物取肺脏组织检测MPO酶活性,并制成病理切片,光镜、电镜下观察肺组织的超微结构形态改变。MPO、PAF试剂盒分别购于南京建成生物工程研究所和美国ADE公司。【结果】1.不同复苏方式孕兔肺组织MPO比较:采取不同液体复苏方案后肺组织MPO表达水平不同,复苏期末肺组织中MPO水平在各组间自高到低排列为NS组（3.05±0.34 U/L）、NH组（2.47±0.23 U/L）、HHH组（1.86±0.25 U/L）。组间比较差异有统计学意义,且HHH组、NH组显著低于NS组,HHH组显著低于NH组（F=27.067,P=0.000）。说明限制性输液复苏较快速输液复苏减轻了休克时中性粒细胞在肺组织的聚集程度。2.不同复苏方式孕兔血浆PAF比较:失血性休克引起血清PAF升高,复苏后血清PAF继续升高,但以NH组、HHH组升高较为缓和,在T180min血清PAF由高到低排列依次为NS、NH、HHH组（4.41±0.12 pg/ml VS 3.97±0.13 pg/mlVS3.57±0.15pg/ml）,且HHH组、NH组显著低于NS组,HHH组显著低于NH组,组间比较有统计学意义（F=58.562,P=0.000）。提示限制性输液从一定程度上下调了血清PAF水平,减轻了炎性介质对机体的损害,高张高胶限制性输液效果更明显。3.病理改变:快速输液复苏组（NS组）较较限制性输液复苏组（NH、HHH组）Ⅱ肺泡细胞表面微绒毛减少、变短或消失,板层体少且空化,线粒体肿胀、嵴减少,排列紊乱。说明限制性输液减轻了肺组织结构的损害。【结论】限制性输液下调了休克后血清PAF的水平,减轻了肺组织中性粒细胞扣押和聚集的程度,有利于缓解局部缺血缺氧区组织细胞的损害。羟乙基淀粉高渗盐限制性输液复苏可显著抑制休克后肺组织中性粒细胞的聚集。提示液体的种类和复苏方式可能影响休克后炎症介质的水平和器官的损害程度。第三章不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克各器官ATP酶活性的影响【目的】休克后缺血缺氧的细胞发生多通路的变化,细胞能量代谢从有氧代谢转变为无氧糖酵解,引起细胞内乳酸、氢离子和无机磷酸盐的堆积。细胞内ATP数量的减少源于合成减少、持续消耗和ATP酶活性的改变。我们应用孕兔非控制性失血性休克模型研究不同的液体复苏方案对孕兔失血性休克时血乳酸、离子及各脏器Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响,分析不同复苏方法对休克后能量代谢的影响。【方法】1、实验分组和方法同第三章。2、监测指标:于实验0min、30min、90min、180min抽血检测LA、Na+、K+水平,实验结束后处死动物取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、小肠和骨骼肌等组织检测Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。Na+、K+采用全自动电解质监测仪（美国康宁公司）监测;LA、ATP酶试剂盒购自南京建成生物工程公司。【结果】1、不同复苏方式孕兔各组织ATP酶活性水平比较:失血性休克引起Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的升高,其中Na+-K+-ATP酶的活性较Ca2+-Mg2+-ATP酶升高显著,NS组较NH、HHH组升高显著;在NS组Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性各脏器组织间的排列自高到低的顺序为骨（7.34±1.41 VS7.04±1.02 umolPi/mgprot/hour）、心肌（6.39±1.28VS6.13±0.83umolPi/mgprot/hour）、肝（6.11±0.97 VS 5.54±0.80 umolPi/mgprot/hour）、肾（5.82±0.69 VS5.54±0.80umolPi/mgprot/hour）、肺（4.14±0.78 VS 3.74±1.04umolPi/mgprot/hour）及肠（3.02±0.37 VS 2.82±0.44 umolPi/mgprot/hour）,NH、HHH组表现与NS组相似的规律。其中Na+-K+-ATPase心肌、骨胳肌、肝、肾组织中活性NS组显著高于NH与HHH组（心肌:F=10.727,P=0.001;骨胳肌:F=8.798,P=0.003;肝:F=11.696,P=0.001:肾:F=28.137,P＜0.001）,肺、肠组织中NS、NH、HHH组间比较无统计学意义（肺:F=1.836,P=0.193;肠:F=1.644,P=0.226）。Ca2+-Mg2+-ATPase活性表现与Na+-K+-ATPase相似的规律。表明休克后不同器官代谢水平不同,限制性液体复苏减轻了由于ATPase活性活性改变所继发的能量代谢紊乱。2、不同复苏方式孕兔血浆乳酸、血钠、血钾水平比较:失血性休克引起血乳酸、血钾水平的增高,院内复苏期末血乳酸仍高于基础期水平HHH组（1.9±0.4mmol/L）、NH组（4.4±1.0mmol/L）显著低于NS组（8.6±1.4 mmol/L）,差异有统计学意义（F=67.758,P＜0.001）;院内期末血钾水平除HHH组（3.30±0.25mmol/L）恢复至基础期（3.09±0.10mmol/L）水平外,其它各组仍继续升高,NS组仍然高于基础期为4.40±0.17mmol/L,NH、HHH组与NS组组间比较,差异有统计学意义（F=48.849,P＜0.001）;血钠浓度仅HHH组院前期表现短暂的升高较基础期升高24.4mmol/L（F=875.948,P＜0.001）,院内期恢复至基础期水平;院内复苏期末骨骼肌组织ATP酶活力和血乳酸水平呈正相关（pearson correlationcoefficient:r=0.895,P=0.000）.说明限制性输液复苏缓解休克时乳酸的增加,减轻代谢性酸中毒,稳定了血浆电解质水平。休克后的高血浆乳酸水平可能与ATP酶活性的改变相关。【结论】孕兔非控制性失血性休克导致能量代谢障碍,不同器官影响不同,其中心肌和骨胳肌较肺、肠组织中ATP酶活性改变显著。限制性输液复苏较快速输液复苏相对稳定了能量代谢及血浆离子水平,减轻对细胞生物膜及细胞器的损害。第四章不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克各器官缺血再灌注损伤的影响【目的】失血性休克后的液体复苏过程类似于缺血再灌注的病理生理改变,是失血性休克后继发的组织损伤的一个重要原因。目前未见孕兔未控制性失血性休克缺血再灌注损伤的相关报道。本研究应用孕兔非控制性失血性休克模型研究不同的液体复苏方案对孕兔失血性休克时各脏器SOD、MDA水平的影响,分析不同复苏方法对组织缺血再灌注的影响,探讨不同复苏方法对休克后续治疗的意义。【方法】1、实验分组和方法同第三章。2、监测指标:实验结束后处死动物取心脏、肝脏、肺脏、肾脏、小肠和骨骼肌等组织检测SOD活性和MDA水平。SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程公司。【结果】1、失血性休克后各器官超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）水平的变化:失血性休克时缺血再灌注损伤导致SOD活性的降低及MDA水平增高;在各组间自高到低排列为NS组、NH组、HHH组,NS组MDA表达水平分别为肺（24.41±2.95 nmol/mgprot）、肝（19.41±2.12 nmol/mgprot）、肾（17.42±3.11nmol/mgprot）、肠（16.21±1.97 nmol/mgprot）、骨胳肌（6.23±3.70 nmol/mgprot）和心肌（5.45±2.52 nmol/mgprot）,其中肺水平最高;NS组SOD表达水平分别为肺（94.20±18.77Ul/mgprot）、肝（94.43±8.19 Ul/mgprot）、肾（113.42±11.67Ul/mgprot）、肠（33.00±7.02 Ul/mgprot）、骨胳肌（168.2±7.89 Ul/mgprot）和心肌（164.0±8.47 Ul/mgprot）,其中骨骼肌表达最高。表明休克后不同器官的缺血再灌注损伤程度不同。2、不同复苏方式孕兔各组织SOD活性及MDA水平比较:其中肺、肝、肾、肠组织中组间比较差异有统计学意义,且MDA水平HHH组、NH组显著低于NS组,HHH组显著低于NH组NH组（肺:F=11.155,p=0.001;肝:F=21.549,p=0.000;肾:F=10.504,p=0.001;肠:F=12.174,p=0.001）;SOD活性HHH组、NH组显著高于NS组,HHH组显著高于NH组（肺:F=9.285,P=0.002;肝:F=12.346,P=0.001;肾:F=11.039,P=0.001;肠:F=25.006,P=0.000）。提示限制性输液复苏孕兔失血性休克能减轻组织缺血再灌注损伤,高张高胶限制性限制性性输液效果更明显。【结论】对非控制性出血性休克模型院前期限制性输液复苏缓解了组织缺血再灌注损伤,高张高胶限制性输液效果更明显。缺血再灌注损伤时,组织器官的损伤程度不同,相互影响,形成恶性循环。因此阻断损伤的始动及主要损伤器官,可能在休克的救治中具有重要意义,但由于样本量有限,缺血再灌注损伤对临床判断休克预后的指导作用有待进一步研究。全文小结1、限制性输液复苏较快速输液复苏微动脉收缩减轻,FCD数目增多,组织灌流增加,动物生存时间延长,生存率提高。高张高胶限制性输液较等渗晶体限制性输液复苏孕兔失血性休克能较明显的改善微循环、减少输液量,可望应用于院前急救。2、限制性输液下调了休克后血清PAF水平,降低了肺组织中性粒细胞扣押和聚集的程度,缓解了由中性粒细胞激活诱发的免疫反应,有利于减轻局部缺血缺氧区组织细胞的损害。3、孕兔非控制性失血性休克后导致能量代谢障碍,不同器官影响不同,其中心肌和骨胳肌ATP酶活性改变显著。限制性输液较快速输液相对稳定了能量代谢及血浆离子平衡,减轻对细胞生物膜及细胞器的损害。4、限制性输液缓解了组织缺血再灌注损伤;缺血再灌注损伤时,组织器官的损伤相互影响,形成恶性循环。因此阻断损伤的始动及主要损伤器官,可能在休克的救治中具有重要意义。综上所述,本文通过不同限制性输液方案复苏孕兔未控制性失血性休克对微循环灌注、缺血再灌注、能量代谢、全身炎症反应综合症等系统研究,探讨其有效复苏的病理生理机制,表明院前复苏期在使用晶体液的基础上联合少量高张高胶限制性输液复苏孕兔非控制性失血性休克可取得更好效果。我们的动物实验数据支持:可在在具备良好实验条件的基础上,严格筛选病例,由有丰富经验的医生负责进行限制性输液的第一阶段临床试验。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克微循环的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克肺损伤的保护作用
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三章 不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克各器官ATP酶活性的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第四章 不同限制性输液方案对孕兔非控制性失血性休克各器官缺血再灌注的影响
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 成果
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明