论文摘要
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是导致肢体严重致残的创伤性疾患，随着我国国民生活水平的提高和交通运输业的快速发展，其发病率也在逐年增加。由于受损的中枢神经组织的再生能力极其有限，故组织损伤后的自身修复就成了一个棘手的难题，因而探讨中枢神经损伤后所发生的一系列病理生理改变机制及其寻找有效的修复方法和途径，促进脑和脊髓功能的恢复已成为神经科学领域急待深入探讨和研究的课题。临床观察发现，脊髓横断性损伤后，患者首先经历各种反射明显降低或消失的休克期，5-10天后逐渐演化为各种反射亢进的痉挛期。脊髓损伤后的这一关键时段所发生的应激性病理生理改变的形态学基础是什么？分子生物学机制如何？目前尚不十分清楚，因而，在临床上如何使用专一、有针对性的有效药物加以治疗也成了一个棘手的问题。研究发现，在SCI的模型中，注射5-羟色胺前体（serotonin precursor）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamin，5-HT）或色胺酸后均可使前角运动神经元进入超敏感状态，推测脊髓前角运动神经元对5-HT敏感性增高可能是SCI后产生痉挛的主要原因之一。目前已知，5-HT系统有7大类型14种亚型，其中5-HT2A受体在中枢下行痛觉调制系统中具有广泛作用，在调解肌张力中也扮演着重要角色。但是，在SCI中，5-HT2A受体的变化和作用机制尚不十分清楚。本研究利用脊髓完全横断性损伤大鼠模型，对损伤段以下前角运动神经元膜受体5-HT2A的变化进行深入细致的研究，以揭示脊髓损伤后病理生理改变的分子形态学基础和机制，为临床有效预防和治疗脊髓损伤后肌痉挛性损伤及脊髓损伤的修复提供有价值的参考资料，同时对大鼠骶髓完全横断损伤后不同时间点神经元、髓鞘及细胞器等所发生的微细改变进行观察研究，从而对SCI后脊髓功能的病生理改变作出更科学合理的解释提供依据。第一部分大鼠脊髓横断性损伤后骶段前角运动神经元5-HT2A受体的表达目的：本研究采用免疫组织化学方法研究脊髓横断性损伤后骶髓节段前角运动神经元内5-HT2A受体（5-HT2A receptor,5-HT2AR）免疫反应（immunoreaction, IR）的变化，以期阐明脊髓损伤后肌反射亢进、肌强直性痉挛发生的分子生物学机制和病生理学改变的形态学基础，为临床治疗提供实验数据。方法：健康清洁级雄性Wistar大鼠140只，随机数字表法分为2h、8h、1d、2d、7d、30d、60d组，每组20只，其中每组又随机分为手术组（n＝10）和假手术组（n＝10），每组10只。手术组以第2腰椎棘突为标志，吸除脊髓第2骶髓节段1～2mm脊髓组织，假手术组保留硬膜的完整性。4%的多聚甲醛溶液灌注固定，完整取出脊髓损伤处以下的骶髓节段。用冷冻切片机制作连续切片（-25℃），片厚40μm。切片经5-HT2AR免疫组织细胞化学染色，激光共聚焦显微镜下观察并摄片，用Adobe Photoshop CS4软件和Image J统计软件分别进行定量分析和统计学处理。先把图像阈值化后，分布在阈值像素水平以上的像素区均为5-HT2AR免疫反应阳性区，用来代表5-HT2AR免疫反应阳性的密度，分别测量脊髓前角（AH），侧索（LF）区内5-HT2AR免疫反应阳性结果的面积占AH和LF区面积的百分比。所得数据经SPSS17.0软件进行统计学处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P <0.05为差异有统计学意义。结果：1.5-HT2AR-IR阳性结果主要分布在脊髓灰质前角和侧索，后角及中央带和中央管周围亦有少量分布。2.2h、8h手术组与假手术组相比，5-HT2AR-IR阳性神经元的密度无统计学差异（P>0.05）。3.1d组中，手术组比假手术组前角5-HT2AR-IR阳性的密度增高了2倍多，差异有显著性（P <0.05）。4.2d、7d、30d、60d组5-HT2AR-IR阳性的密度手术组比假手术组明显增高，有高度显著性差异（P <0.01）。结论：1．大鼠脊髓骶段横断性损伤1d后，5-HT2AR-IR水平开始上调，2d后明显上调，其上调持续时间长达60d。2．5-HT2AR阳性结果主要分布于前角的神经元胞体区和侧索的树突区，运动神经元胞体所在部位，最为密集。3．5-HT2AR随时间增长的持续上调与前角运动神经元失去5-HT能神经支配时间的延长之间有十分密切的时间关系。4．5-HT2AR的上调与脊髓去5-HT神经支配后的超敏反应密切相关，亦是脊髓损伤后出现病理性肌反射亢进、强直性痉挛的分子生物学基础。第二部分大鼠脊髓横断性损伤后骶段前角超微结构的观察目的：本研究制备大鼠脊髓骶段横断损伤模型，应用电子显微镜观察不同时间段内神经元胞体、树突及髓鞘等超微形态结构的变化特征，以探讨脊髓损伤后的超微病理改变，为脊髓损伤的修复提供形态学依据。方法：雄性Wistar大鼠48只，随机数字表法分为正常对照组和脊髓横断手术组2h、8h，1d、2d、7d、30d、60d组，共8组，每组6只。手术组以第2腰椎棘突为标志，后正中切口去除脊髓第2骶髓节段1～2mm的脊髓组织。各组用4%多聚甲醛、2%戊二醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制）混合固定液灌注，2h后取出脊髓，切取损伤处以下骶髓节段。常规电镜样品制备，铀、铅双染，电镜下观察并摄片。结果：1．正常脊髓的神经元胞体规则，核膜清晰，核内染色质均匀，核仁明显，大而圆，位于胞体中央，胞浆内粗面内质网的核糖体排列规则，线粒体呈椭圆形，嵴清晰，髓鞘板层结构排列整齐。2．脊髓损伤后2h，神经元肿胀，髓鞘板层开始散乱、扭曲。脊髓损伤后8h，神经元以坏死为主，细胞核肿胀、核膜凹凸不平，有的崩解，膜结构模糊不清，线粒体部分嵴断裂，溶酶体增多；髓鞘板层结构紊乱，出现囊性间隙。3．脊髓损伤后1d，神经元胞浆广泛水肿，细胞膜断裂、溶解，胞核浓缩、异染色质边聚，线粒体空泡样变，粗面内质网松散、脱颗粒；髓鞘板层结构进一步分离、破裂。4．脊髓损伤后2d，胞质溶解，细胞器结构破坏较严重，核碎裂，高尔基体扁囊溶解；髓鞘肿胀更甚,其内可见肿胀的线粒体。5．脊髓损伤后7d，神经元染色质边聚，核仁消失，胞浆内细胞器结构破坏，细胞膜边界不清，髓鞘板层分离，断裂、扭曲，线粒体肿胀增生。6．脊髓损伤后30d，部分神经元胞核尚规则，形态接近正常，异染色质稍浓密，线粒体部分肿胀。胶质细胞增生明显，部分有少量髓鞘包绕，轴索及髓鞘崩解，成为空泡，髓鞘水肿减轻，髓鞘板层分离程度减轻。7．脊髓损伤后60d，神经元数量较少，形态接近正常；髓鞘部分缺失，中间有纤维填充，脊髓部分区域失去了神经组织结构，为神经胶质及纤维所代替。结论：1．脊髓损伤2h后，其超微形态观察运动神经元和轴突的髓鞘已经发生超微病理性改变。2．脊髓损伤后8h至7d，其神经元细胞器和髓鞘的超微病理性改变均趋于加重，以细胞器的坏死为主。3．脊髓损伤30d至60d，神经元细胞器及大部分髓鞘出现了不可逆的明显的病理性变化，但表现在细胞核的改变，其超微形态却有所恢复。
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