动物源性食品中硝基呋喃类药物残留分析研究

论文摘要

本研究旨在检测硝基呋喃类代谢物的残留,合成了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）,对于呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因三种药物的代谢物（AOZ、SEM、AHD）合成了免疫原并且制备了相应的多克隆抗体。其中针对呋喃妥因代谢物残留建立并优化了间接酶联免疫方法（ic-ELISA）,针对呋喃西林代谢物研制了一种快速检测的胶体金免疫层析试纸条。实验首先合成了呋喃唑酮代谢物AOZ,并用仪器鉴定其纯度,完全适合作为标准品使用。然后针对AOZ、SEM和AHD三种代谢物设计了结构合理的半抗原,进行衍生化合成,并用仪器确定了其最终纯度。使用两种方法使半抗原分别与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联合成免疫抗原和包被抗原,并对其进行偶联效果的鉴定。每种免疫原采用2只新西兰大白兔进行免疫,按照既定免疫程序,监测免疫后抗血清效价。进行了4个多月的反复免疫直到获得满意的抗血清效价,采集全部抗血清并进行纯化,最终经过筛选得到每组中较好的抗血清效价分别为153600,307200和614400,完全符合免疫实验要求,并作为之后的免疫分析抗体。选择呋喃妥因代谢物AHD的抗体建立了相应的间接竞争ELISA方法,并对包被条件、封闭条件、竞争时间等条件进行了优化测定,并且从灵敏度、特异性和准确性三个方面进行了评估。最终优化后ELISA方法的IC50为3.6 ng/mL,LOD（90%抑制率对应的浓度）为0.085 ng/mL;该抗体不与其结构类似物等有明显交叉反应,特异性良好;通过对猪肉样本添加不同剂量标准品AHD,并对其用苯甲酸进行衍生化处理作为目标检测物,最后检测实际样本回收率和变异系数均达到兽药残留分析要求。此外,对于呋喃西林代谢物SEM抗体建立了胶体金免疫层析方法并对其进行了优化。首先制备了18 nm的胶体金溶液,标记抗体并且纯化。对重悬液、抗原稀释液等反应溶液进行了筛选比较。对优化后试纸条的性能进行了评测,裸眼检测限达到40 ng/mL,而且对类似物检测时无交叉反应。实验还对试纸条的可靠性做了确认,设置80个标准样本进行测试,并用ELISA方法作了平行实验,结果两种方法的一致率达到98%。本实验一方面制备了灵敏度高、特异性良好的硝基呋喃代谢物抗体,可供今后免疫检测分析使用,另一方面建立的AHD间接ELISA方法和SEM胶体金免疫层析方法既满足了对硝基呋喃药物的残留检测,也为今后对硝基呋喃类代谢物免疫检测的进一步研究提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 硝基呋喃类概论
• 1.1.1 硝基呋喃类的理化性质
• 1.1.2 硝基呋喃类的药理性质及应用
• 1.1.3 硝基呋喃类的代谢与分布
• 1.1.4 硝基呋喃类的危害与残留现状
• 1.2 硝基呋喃的仪器检测技术
• 1.2.1 高效液相法（High performance liquid chromatography, HPLC）
• 1.2.2 液相色谱-质谱连用法（Liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS）
• 1.2.3 液相色谱串联质谱法（Liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry, LC-MS/MS）
• 1.3 硝基呋喃的免疫分析方法
• 1.3.1 酶联免疫测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）
• 1.3.2 胶体金免疫分析检测技术
• 1.4 本课题研究的内容、目标
• 第二章 硝基呋喃类代谢物完全抗原的合成与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 药品与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.1.3 溶液系统
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone, AOZ）的合成
• 2.2.2 AOZ 的鉴定
• 2.2.3 半抗原的制备
• 2.2.4 半抗原的鉴定
• 2.2.5 完全抗原的制备
• 2.2.6 完全抗原的鉴定（紫外分光光度法）
• 2.3 结果
• 2.3.1 代谢物AOZ 的鉴定
• 2.3.2 半抗原的鉴定
• 2.3.3 完全抗原的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 间隔臂的选择
• 2.4.2 载体的选择
• 2.4.3 交联方法的选择
• 2.4.4 最佳交联比
• 2.5 本章小结
• 第三章 硝基呋喃类代谢物抗体的制备与鉴定
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 主要溶液
• 3.1.3 仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 抗血清的制备
• 3.2.2 抗血清的分离与保存
• 3.2.3 抗血清的纯化
• 3.2.4 抗体效价的测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 抗血清纯化的结果分析
• 3.3.2 抗体的效价
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 间接ELISA 方法的建立和优化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 药品和试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 溶液系统
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 AHD 的间接ELISA（Competitive indirect ELISA, ic-ELISA）方法的建立
• 4.2.2 ic-ELISA 各参数的优化
• 4.2.3 ic-ELISA 方法评估
• 4.3 结果
• 4.3.1 ic-ELISA 各参数的确定
• 4.3.2 优化后的ic-ELISA
• 4.3.3 ic-ELISA 方法评估
• 4.4 讨论
• 4.4.1 ELISA 方法的影响因素和优化
• 4.4.2 ic-ELISA 的评估
• 4.5 本章小结
• 第五章 胶体金免疫层析试纸条的研制
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 试纸条材料
• 5.1.4 溶液系统
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 胶体金的制备
• 5.2.2 胶体金标记抗体蛋白
• 5.2.3 溶液系统的筛选
• 5.2.4 试纸条膜的选择
• 5.2.5 试纸条的组装
• 5.2.6 试纸条的测试方法
• 5.2.7 试纸条质量性能测试
• 5.3 结果
• 5.3.1 抗体浓度测定
• 5.3.2 胶体金的质量鉴定
• 5.3.3 胶体金标记抗体蛋白
• 5.3.4 溶液系统的筛选
• 5.3.5 试纸条的组装与测试
• 5.3.6 试纸条质量性能测试
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文