抗奶牛乳腺炎特异性卵黄抗体的制备及活性研究

论文摘要

奶牛乳腺炎是一种给奶牛养殖业造成巨大经济损失的疾病,主要采用抗生素治疗。抗生素疗法会引起动物体内甚至牛奶中药物残留和细菌耐药性的增强,间接危害人类健康。因此,寻找一种安全、高效的抗生素替代品成为一个亟待解决的问题。特异性卵黄抗体(Egg yolk immunoglobulin,IgY)可治疗由细菌或病毒感染引起的疾病,具有安全无残留、不产生抗药性、价廉易得等优点,是一种具有广阔应用前景的抗生素替代品。本研究制备了抗奶牛乳腺炎主要致病菌——金黄色葡萄球菌和大肠杆菌特异性卵黄抗体,考察了抗体的体外抑菌活性、对吞噬细胞的吞噬调理作用及对奶牛乳腺炎的治疗作用。分别以灭活的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌免疫蛋鸡制备卵黄抗体。ELISA检测表明,抗体最高效价可达25600,抗体高效价(≥6400)可持续100天;抗原浓度、蛋鸡日龄和佐剂等影响免疫效果。特异性IgY含量随时间变化趋势与抗体效价变化趋势基本一致,每毫升卵黄液中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌特异性IgY的最高含量分别可达1.86mg和1.88 mg,总IgY的平均含量分别为9.82 mg和9.95 mg。采用水稀释—盐析—超滤—凝胶过滤技术从卵黄中分离纯化IgY,经超滤、凝胶过滤后抗体纯度分别可达87.09%和94.52%,回收率分别为100.6 mg/egg和27.68 mg/egg。水稀释—盐析—超滤法所得抗体纯度高、产量大,适于大规模分离纯化。体外抑菌实验表明,两种特异性IgY均以剂量依赖方式抑制抗原菌在液体培养基中的生长,大肠杆菌特异性IgY浓度为20 mg/mL,金黄色葡萄球菌特异性IgY浓度为10mg/mL时能完全抑制细菌在液体培养基中的生长。两种特异性IgY对牛奶中分离的5株大肠杆菌和5株金黄色葡萄球菌分别具有生长抑制活性。免疫荧光和免疫电镜结果表明特异性IgY与细菌结合,使细菌表面结构发生改变。细菌经荧光素标记,采用流式细胞技术检测特异性IgY对奶牛体内吞噬细胞噬菌作用的影响。特异性IgY浓度为1 mg/mL时对吞噬细胞的吞噬促进作用最强。该浓度IgY使外周血PMN吞噬金黄色葡萄球菌的吞噬率由60.2%升高到90.5%,乳中PMN吞噬金黄色葡萄球菌的吞噬率由52.95%升高到82.45%;乳中PMN和Mφ吞噬金黄色葡萄球菌的吞噬率分别提高29.5%和27.66%,吞噬大肠杆菌的吞噬率分别提高26.5%和26.36%,IgY对两种细胞的吞噬促进作用差异不明显(p＞0.05)。乳池内分别注射抗金黄色葡萄球菌特异性IgY(200 mg)和青霉素(1000 mg)治疗金黄色葡萄球菌引起的实验性乳腺炎和临床型乳腺炎,6天治疗期内牛奶颜色和奶中凝块得到明显改善;体细胞数和细菌计数显著降低。IgY和青霉素对实验性乳腺炎的治愈率分别为83.3%和66.7%,对临床型乳腺炎的治愈率分别为50%和33.3%。综上所述,本研究成功制备出抗奶牛乳腺炎致病菌特异性IgY,考察了其体内外活性,并证明了其对奶牛乳腺炎的疗效优于青霉素。为特异性IgY替代抗生素治疗奶牛乳腺炎提供了依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 IgY的研究进展
• 1.1.1 IgY的结构及免疫学特性
• 1.1.2 IgY的稳定性
• 1.1.3 IgY的分离纯化
• 1.1.4 IgY的应用
• 1.1.5 IgY的作用机理
• 1.2 奶牛乳腺炎的研究进展
• 1.2.1 乳腺炎的分类
• 1.2.2 乳腺炎的致病因素
• 1.2.3 乳腺炎的发病机理
• 1.2.4 乳腺的防御机理
• 1.2.5 乳腺炎的检测
• 1.2.6 乳腺炎的治疗
• 1.3 本研究的目的、意义和主要工作
• 参考文献
• 2 特异性卵黄抗体的制备及分离纯化
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料及设备
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 仪器
• 2.2.5 溶液配置
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 细菌培养及免疫原制备
• 2.3.2 蛋鸡免疫
• 2.3.3 IgY的分离、纯化
• 2.3.4 抗体效价检测
• 2.3.5 抗体含量测定
• 2.3.6 SDS-PAGE检测蛋白纯度
• 2.3.7 统计学分析
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 免疫影响因素
• 2.4.2 抗体效价
• 2.4.3 抗体含量
• 2.4.4 抗体纯度
• 2.5 讨论
• 2.5.1 免疫影响因素
• 2.5.2 抗体分离纯化
• 2.5.3 抗体含量
• 2.6 小结
• 参考文献
• 3 特异性卵黄抗体的体外抑菌活性
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料及设备
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 实验动物
• 3.2.3 试剂
• 3.2.4 仪器
• 3.2.5 溶液配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 特异性IgY对抗原菌的生长抑制
• 3.3.2 奶牛乳腺炎致病菌的分离
• 3.3.3 特异性IgY与分离菌的结合活性
• 3.3.4 特异性IgY对分离菌的生长抑制作用
• 3.3.5 免疫荧光
• 3.3.6 免疫电镜
• 3.3.7 统计学分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 菌浓度确定
• 3.4.2 特异性IgY最低凝集浓度
• 3.4.3 特异性IgY对抗原菌的生长抑制活性
• 3.4.4 致病菌分离结果
• 3.4.5 特异性IgY与奶中分离菌的结合活性
• 3.4.6 特异性IgY对分离菌的生长抑制活性
• 3.4.7 免疫荧光与免疫电镜检测
• 3.5 讨论
• 3.6 小结
• 参考文献
• 4 特异性IgY的吞噬调理作用
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料及设备
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 实验动物
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 奶牛外周血中吞噬细胞的分离
• 4.3.2 奶牛乳中吞噬细胞的分离
• 4.3.3 荧光素FITC标记金黄色葡萄球菌
• 4.3.4 吞噬时间选择
• 4.3.5 流式细胞检测与细胞染色法测定PMN噬菌作用的比较
• 4.3.6 特异性IgY对血液及乳中PMN噬菌作用的影响
• 4.3.7 特异性IgY对乳中PMN及Mφ噬菌作用的影响
• 4.3.8 统计学分析
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 标记条件的确定
• 4.4.2 检测方法的确定
• 4.4.3 吞噬时间的确定
• 4.4.4 特异性IgY对外周血及乳PMN噬菌作用的影响
• 4.4.5 特异性IgY对奶牛乳中吞噬细胞噬菌作用的影响
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 参考文献
• 5 卵黄抗体对奶牛乳腺炎的治疗作用
• 5.1 前言
• 5.2 实验材料及设备
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 实验动物
• 5.2.3 试剂
• 5.2.4 实验仪器
• 5.2.5 溶液配置
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 给药方式确定
• 5.3.2 给药间隔确定
• 5.3.3 乳腺炎的判定及诱发
• 5.3.4 实验分组及给药
• 5.3.5 乳腺外观及牛奶性状评价
• 5.3.6 体细胞计数
• 5.3.7 细菌计数
• 5.3.8 治愈率
• 5.3.9 统计学分析
• 5.4 结果与分析
• 5.4.1 给药方式确定
• 5.4.2 给药间隔确定
• 5.4.3 乳腺外观变化
• 5.4.4 牛奶性状变化
• 5.4.5 体细胞数变化
• 5.4.6 细菌计数变化
• 5.4.7 治愈率
• 5.5 讨论
• 5.6 小结
• 参考文献
• 6 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 创新点摘要
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢