论文摘要
低温寒害是农业生产中的一种严重自然灾害，世界上每年因此造成的损失高达2000亿美元。作物的抗寒性状是由多基因控制的，只有成簇抗性相关基因的转录激活，才能有效提高作物的抗寒能力。克隆并鉴定调控抗寒功能基因表达的转录因子成为这一研究领域的热点。目前已经从多种植物中发现CBF（C-repeat Binding factors）冷调控转录因子，其功能也已得到验证。CBF转录激活因子可与COR（cold-regulated）基因启动子区域的CRT／DRE（C-repeat／dehydration responsive element）调控元件特异结合，并激活一系列COR蛋白的表达，从而提高植物的耐寒性。本文利用PCR技术，首次从抗寒植物山定子中分离低温诱导转录因子CBF基因，并进行了克隆与序列分析（基因银行注册号码为EF582842）；同时，构建了山定子转录因子CBF基因的植物表达载体，并通过花序浸泡法进行了拟南芥的遗传转化研究，主要的研究结果如下：1．通过将GenBank上发表的几种植物的CBF同源基因进行比较在其保守区域设计一对兼并引物，采用RT-PCR和常规PCR方法对山定子转录因子CBF基因中间片段进行克隆，得到一大小为461bp的片段，并在此中间片段基础上设计了两对特异引物，采用反向PCR方法对山定子转录因子CBF基因的旁侧序列进行克隆，结果获得一长度为1841bp的片段，与中间片段拼接得到一大小为2284bp的片段，其中包含完整的开放阅读框从第790位的起始密码子到第1545位的终止密码子，推测的编码蛋白的氨基酸序列含251个氨基酸残基。然后在预测的编码区两端设计一对特异引物对山定子基因组进行扩增，测序结果得到的序列与拼接所得的序列在编码区内完全一致。应用DNAman软件将推测的山定子转录因子CBF基因编码区与Genebank上发表的几种植物CBF基因进行氨基酸同源性比对，结果发现山定子CBF转录因子MbCBF和樱桃（Prunusavium）DREB基因的氨基酸同源性为66.93％；与橡胶树（Hevea brasiliensis）同源性为55％，这说明我们已经成功地克隆了山定子转录因子MbCBF基因。2．对山定子转录因子CBF基因的核苷酸序列以及由此推导出的氨基酸序列进行了序列比对和功能、结构分析，得出以下结论：1)山定子转录因子CBF基因与其它植物CBF基因在核苷酸和氨基酸水平上有很高同源性；2)山定子转录因子CBF基因编码一酸性蛋白，等电点pⅠ为5.01，预测分子量为27.9KD；3)山定子转录因子CBF氨基酸序列含有一个功能区AP2结合域。在AP2结合域的两端拥有PKK／RPAGRxKFxETRHP和DSAWR两段短多肽序列；4)山定子转录因子CBF氨基酸序列拥有酸性活化区域，无核定位信号和信号肽，无跨膜结构；5)山定子转录因子CBF氨基酸序列中有和CBF家族中保守的α螺旋区和β折叠区；6)用同源建模法模拟出山定子转录因子CBF的空间结构模型；7)通过对山定子转录因子CBF基因的系统发育树分析得出，山定子转录因子CBF基因与苹果属樱桃的DREB基因具有相近的起源。3．构建山定子转录因子CBF基因的植物表达载体，即首先设计一对含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位点的特异引物P5F、P5R，从山定子基因组DNA中分离CBF基因的编码区。然后应用限制性内切酶BamHⅠ和SacⅠ分别对质粒pBⅠ121和PCR产物进行酶切，用酶切的PCR产物替换质粒pBⅠ121中的GUS基因，获得山定子转录因子CBF基因的植物表达载体pBC35S。4．采用花序浸泡法将山定子转录因子CBF基因成功转入拟南芥中，为进一步的功能鉴定奠定了基础。